Разное99 на разварках: Изготовление разварок Москва ЮАО — Публикации

99 на разварках: Изготовление разварок Москва ЮАО — Публикации

Содержание

Автоклуб ВАЗ 2101

Alimhad (42), ангел (60), MarkFlavius (34), Prostavka (52), Виталик ТАЗОВОД (37), Dimitrius (34), sansanych2985 (37), boomprint (35), dsansanych (37), Shony (34), Василич (29), Ігор Михайлович (52), Андрейка S (40), nbbnnz (36), refresh (34), Паша lermontov (33), denya_os (33), Extazmo (42), Serg_DN (56), Leon22 (59), Vovan 21013 (34), fruk78 (41), Сергей37 (

49), Kozak (33), Valentyn (32), Slavvva (43), Миклош 21011 (65), westp (43), Сергей РЕНО (37), Dgango (45), Роман 77 (31), Валёк (55), Skiba76 (46), sunsun2011 (58), колюня (36), neindyAbete (47), yrhic (35), vladimir_v (47), Stahanov (37), Cheldon (39), Edvard (47), sarmen32 (55), миша 21011 (35), сергей75 (47), Аллочка (40), sanyo (45
), valart (43), GANS (52), Stiff (29), MaksimF1 (23)

Диски Разварки ВАЗ ГАЗ ИЖ АЗЛК R13 R14 Розварки Кременчуг UA

Шумоизоляция,Виброизоляция «Визол» 1,5мм 330х500мм Украина

Харьков Запчасти / аксессуары

⭕ Більше інформації на нашому сайті: http://gumteks. com.ua/g11188037-materialy-dlya-vibroizolyatsii Ціна вказана при купівлі пачки- 25 листів. Роздрібну ціну уточнюйте. Віброізоляція «Візол» Україна 1,5мм 330х500 60мкм Ця віброізоляція була розроблена на науково-дослідній базі НТУ «Харківський Політехнічний Інститут». У звязку із складною економічною ситуацією в країні, нами було прийнято рішення створити для більшості покупців дешевший, доступніший, а головне — якісний вид віброізоляції «Візол» Україна виключно з компонентів вітчизняного виробництва. Основні характеристики: Товщина листа — 1,5мм Розмір — 330 х 500мм Кількість листів в упаковці — 25. Вага упаковки — 9 кг Реалізація товару від виробника. Цена ук…

авто багажник Thule MOTION 200

Сумы Запчасти / аксессуары

⭕ Бокс новый, в плёнке, упаковка. Цвет-черный. Торг. Телефон ✆ 067-747-67-38

Запчасти к мотоблокам Зубр, Кентавр, Форте, Зоря, Добриня и др.

Ровно Запчасти / аксессуары

⭕ Запчасти к мотоблокам Зубр, Кентавр, Форте, Зоря, Добриня и др. http://samrem.com.ua/zapchasti В наличии и под заказ: двигателя, форсунки, распылители, прокладки, кольца, поршневые комплекты, вкладыши, фильтры (масляные, топливные, воздушные), головка цилиндра, клапана, сальники, подшипники, радиатор, стартер и много другого. Телефон ✆ 096 484 5997 050 986 3080

Cayenne 958

Одесса Запчасти / аксессуары

⭕ После смены обвеса остатки, наличие уточняйте Телефон ✆ 067 517 3759

стремянки рессор

Киев Запчасти / аксессуары

⭕ по всім запитанням пишіть на імейл або залишайте номер телефону я Вам зателефоную. Телефон ✆ 0505043116

Выключатель массы-электронный C дистанционным управлением ВМ-371/12в

Запорожье Запчасти / аксессуары

⭕ электронный выключатель массы с дистанционным управлением ВМ-371/12в-новые советского производства Выключатель массы 12 V, электронный с дистанционным управлением, модель ВМ-371. Рамеры ВхШхД 55х35х60 мм. Монтируется на клемму минус аккумулятора. Управление из салона, что очень удобно. Выполняет ещё роль противоугонного устройства, состоит из аккумуляторной клеммы,магнитной системы из двух катушек типа РЭС-22,но с более мощной контактной группой. потребляемая электрическая мощность ВМ-371 при включенном состоянии — 2 Вт. контактная группа 60-70 ампер. клемма минус-латунная,покрыта серебром. болт массы медный. клемма плюс-латунь латунный концевик-клемма на массу цена 180гр. схема подключения на фото. полный комплект установки в который вхо…

Продам лодочные моторы SUZUKI

Днепропетровск Запчасти / аксессуары

⭕ Продам новые подвесные ( 2-х и 4-х тактнны) лодочные моторы модельного ряда SUZUKI c последующим гарантийным обслуживанием. Гарантия на моторы SUZUKI при коммерческом применении: DF2,5 – DF30 – 12 месяцев DF40 – DF300 – 12 месяцев DТ15 – DT40 – 12 месяцев При личном использовании: DF2,5 – DF30 — 36 месяцев DF40 – DF300 — 36 месяцев DT15 – DT40 — 24 месяца Бонус покупателю – безплатная установка мотора на катер (лодку). Телефон ✆ 0916453776

Автомагнитола JVC KW-R910BT

Львов Запчасти / аксессуары

⭕ Доставка з Польщі Відправка Новою поштою 1-3робочих дня Фирма:JVC Наименование (марка):KW-R910BT CD+MP3+USB ресивер со съемной панелью Состав 1. Тюнер есть, цифровой 2. CD-проигрыватель есть 3. MP3-проигрыватель есть 4. DVD-проигрыватель нет 5. Усилитель есть 6. Эквалайзер есть 7. ТВ-тюнер нет Поддерживаемые носители и форматы 1. Форматы CD-audio, MP3, WMA 2. Носители CD-R, CD-RW 3. Управление 4. Инфракрасный пульт нет 5. Джойстик на руле нет 6. Пауза при разговоре по телефону есть 7. Автопоиск станций есть Тюнер 1. Поддержка диапазонов FM, УКВ, СВ 2. Поддержка RDS RDS, RDS/EON, RDS/PTY 3. Переключение стерео/моно есть 4. Тюнер с дальним приёмом есть 5. Число предустановок FM/AM 18 / 6 Общие характеристики 1. Номинальная и пиковая мощност…

Усилитель бампера перед Форд Транзит Ford Transit 2004р.в

Жидачев Запчасти / аксессуары

⭕ Стан ідеальний не кривий не покручений висилаю тільки наложним Телефон ✆ 096 948 7545

Блок мотора 1.

6 бензин Ауди Audi VW Golf, Passad B2

Киев Запчасти / аксессуары

⭕ блок 1.6 бензин, мотор неклинив, робив чітко без перепадів, єдина проблема це підбирав масло, розібраний 9.06.2016, також є решта запчастин все в гарному стани (номінал). Телефон ✆ 063 925 8552

Бензонасос Омега а

Киев Запчасти / аксессуары

⭕ Снятый с рабочей машины Телефон ✆ 093-579-53-31

моторчик ветилятора Audi A4 B5,passat B5

Кривой Рог Запчасти / аксессуары

⭕ оригинальный моторчик в отличном рабочем состоянии,снят с донора с европы. Телефон ✆ 067 988 1764

Разборка Chevrolet Nubira (Lacetti) 1.8 АКПП

Донецк Запчасти / аксессуары

⭕ Без ДТП Состояние очень хорошее Автомат Двигатель Корейская сборка Донецк Звонить феникс триста девять девяносто семь девяносто один Вайбер 500 Телефон ✆ 0661030180

Вкладыши коренные ЗАЗ 968м(40)-0,25 новые

Комсомольск Запчасти / аксессуары

⭕ Комплект новых заводских коренных вкладышей 0,25. небольшой торг.Черные точки это промасленные опилки. Телефон ✆ 098 525 4103

Оригинальные диски+новые шины R17 на BMW F10

Киев Запчасти / аксессуары

⭕ Состояние дисков идеальное, как новые, использовались мало, заменили на большие. Х-ки: 8J 5*120 R17 ET 30, 236 стиль по каталогу BMW К ним куплена резина, абсолютно новая Hercules Avalanche X-treme Passenger 225/55 R17 97Т M+S зимняя шипованая Вопросы, подробности по телефону. Здесь сообщения не пишите. Телефон ✆ 073 133 9544

резина летняя и Зимняя R16C 215/65/16с/225/65/16с.?235/65./16с

Киев Запчасти / аксессуары

⭕ мишелин,гудиер,континенталь .большой выбор разных размеров на все авто.легковые,бус,джип.есть все.R13-R21 Телефон ✆ 067 747 5888 5926609

колодкі тормозні задні для Golf Jetta

Киев Запчасти / аксессуары

⭕ Нові в коробці не користуванні Телефон ✆ 068 508 0598

Ремні генератора кондиціонера помпи ніссан

Борислав Запчасти / аксессуары

⭕ Ремні для ніссан Х-Терра та інших моделей дивіться по номеру та фото відправлю по Україні. 3шт Телефон ✆ 063 853 6430

Aprilia Sr Factory

Мукачево Запчасти / аксессуары

⭕ Сиденье пассажира,в хорошем состоянии Телефон ✆ 095 465 9512

Разборка Opel Vectra B 1.6

Тальное Запчасти / аксессуары

⭕ Розборка Opel Vectra B 1.6 Седан. Колір Червоний — як на фото. Наявність запчастин запитуйте по номеру мобільного, або на олх. Відправка кожен день зо 16:00. Замовлення приймаю з 10:00 до 20:00 Телефон ✆ 063-595-29-12

Разварка дисков | АвтоДискиUA

Среди большинства современных водителей особой популярностью пользуется тюнинг автомобилей. Ведь каждый стремится выделиться из толпы машин на дорогах родного города и не только. Кто-то прибегает к покраске авто в нестандартный цвет, кто-то крепит спойлер либо устанавливает оригинальные фары. Для тех же кому интересен еще более необычный тюнинг многие автолюбители предлагают модернизовать колеса путем разварки дисков. Довольно часто такая модернизация встречается на спортивных машинах, однако на обычных автомобилях такое не редкость. Давайте вместе разберемся, что собой представляет данный вид тюнинга и какие его сильные, слабые стороны.

Разварка дисков, что собой представляет?

Под разваркой диска подразумевают увеличение его ширины. С такими катками у автомобиля меняется внешний вид. Он становиться куда интереснее! Зачастую, разварка диска производится на традиционной штампованной дисковой продукции, известной в народе, как «штамповка». Для достижения увеличения колеса прибегают к нескольким способам:

  1. Да одинаковых диска разрезаются в определенном месте, а затем свариваются. В результате увеличивается ширина колеса. Недостаток такого метода выступает использование сразу двух комплектов дисковой продукции.
  2. Каток разрезают пополам и соединяют данные половинки с помощью полосы металла. В таком варианте разварки нет никаких ограничений относительно ширины изделия.
  3. Комбинированный вариант предусматривает также разрезание диска, в котором ступичную часть переносят вниз, а для того, чтобы колесо стало шире, используют металлические полосы.

В результате любого из вышеперечисленных методов диск становиться значительно шире, нежели стандартный вариант. Как правило, резину для таких шин выбирают более узкую и устанавливают «домиком». Здесь стоит отметить, что в зависимости от марки автомобиля некоторые специалисты разрезают арку. Как правило, такая манипуляция необходимо для заниженных автомобилей.

Плюсы и минусы такого тюнинга

Как показывает практика, разварка дисков имеет весьма спорные, как достоинства, так и недостатки. Бесспорно, многие сторонники такого вида улучшения своего транспортного средства углубляются в историю, когда на «гоночные» жигули устанавливали подобные катки, но там опускают некоторые моменты. Итак, среди достоинств такого варианта тюнинга можно назвать только улучшенный внешний вид и тот на любителя. А вот недостатков будет немало и среди них стоит выделить:

  1. Большой вес разварки, что существенно увеличивает нагрузку на подвеску и тем самым ускоряет процессы ее износа.
  2. Стоимость. Такие покрышки купить в свободной продаже не так просто, поэтому и цена немаленькая.
  3. «Подлом резины» более вероятный, несмотря на доводы, что при установке покрышек «домиком» они становятся значительно жестче.
  4. Трудности в обслуживании. Не на каждом сервисе возможно подкачать правильно покрышку, так как не все мастера смогут накачать колеса методом взрыва.
  5. Доверить разварку дисков можно исключительно профессионалам. В противном случае травля воздуха сквозь швы не исключена.

Бесспорно, недостатков у такого украшения транспортного средства масса, несмотря на его высокую популярн6ость. Если же Вы также посматриваете на данный вариант тюнинга, то обязательно взвесьте все за и против, прежде чем вкладывать свои деньги.

5 февраля 2019

Динамика перехода миозинового стержня в состояние спираль-спираль, определяемая с помощью спектра силы диссипации

Подготовка образца

Очищенный скелетный миозин II кролика (9,4 мг/мл) был щедрым подарком профессора П. Найта (Университет Лидса, Лидс). , Объединенное Королевство). (C47S C63S I27) 5 представляет собой конкатенированный пентамерный вариант домена I27 (или I91, используя альтернативную номенклатуру) дистальной области сегмента I-диапазона тайтина сердца человека. (C47S C63S I27) 5 экспрессировали в Escherichia coli и очищали, как описано ранее (18,19).Обычно 2 мкл мкл раствора миозина или I27 (1 или 0,05 мг/мл соответственно) (20) капали на золотую поверхность, только что очищенную от темплата. После инкубации в течение 5 мин поверхность золота промывали измерительным буфером (600 мМ ацетата натрия, 600 мМ KCl, 25 мМ имидазола, 4 мМ MgCl 2 и 1 мМ дитиотреитола, pH 7,4) для удаления несвязавшихся белков. Все измерения проводились при комнатной температуре (∼25°C).

Измерение вязкоупругости одиночных молекул

Аппаратура и процедура измерения вязкоупругости одиночных молекул с использованием магнитных колебаний кантилевера АСМ были описаны ранее (14). показывает принципиальную схему системы. Намагниченный кантилевер АСМ, растягивающий одиночную молекулу стержня миозина, колеблется под действием внешнего магнитного поля переменного тока. Отклонение, сигнал z-сенсора и выходные сигналы синхронного усилителя (7265, Signal Recovery, Oak Ridge, TN) записывались вспомогательным персональным компьютером (ПК) ( PC2 ) через плату сбора данных (NI- 6014, National Instruments, Austin, TX) с частотой дискретизации 50 кГц и перед анализом усреднялись по времени в течение 3 мс, как описано ниже.

Схема экспериментальной установки для измерения вязкоупругости одиночных молекул. Колебательная сила прикладывается к кантилеверу через магнитный шарик, закрепленный на конце кантилевера. Сигнал переменного тока (сгенерированный функциональным генератором) анализируется синхронным усилителем и фиксируется в PC2. PC1 управляет пьезоэлектрическим столиком для выполнения обычной силовой спектроскопии одиночных молекул.

Мы использовали небольшой прямоугольный кантилевер (BL-AC40TS-C2 Biolever-mini, Olympus, Токио, Япония), чья жесткость и резонансная частота обычно равны 0. 1 Н/м и 20 кГц (в жидкости) соответственно. Частица NdBFe была приклеена к краю задней стороны кантилевера для сильного намагничивания. Использование небольшого кантилевера облегчает измерение вязкоупругости одной белковой молекулы с повышенным отношением сигнал/шум из-за результирующего снижения гидродинамического сопротивления кантилевера. При измерениях часть миозина или (C47S C63S I27) 5 захватывается кантилевером за счет физсорбции (неспецифического взаимодействия).Прикрепленная молекула вытягивалась с постоянной скоростью 100 нм/с. Во время растяжения к кантилеверу постоянно прикладывалась колебательная сила через колеблющееся магнитное поле.

Колебательное движение свободного кантилевера было проанализировано с помощью модели простого гармонического осциллятора с демпфированием силы, описанной ранее (14). Амплитуда A и фазовый сдвиг δ на частоте возбуждения ν (в Гц) записываются как

A=F{kc−mc×(2πν)2}2+ζc2×(2πν)2+ DC

(1)

и

δ=tan−1[ζc×2πνkc−mc(2πν)2]+DCδ+aν,

(2)

, где F — магнитная движущая сила; k c , m c , ζ c — коэффициенты жесткости, массы и трения свободного кантилевера соответственно; и DC , DCδ и a — инструментальные параметры (амплитудный сдвиг, произвольный постоянный фазовый сдвиг и линейная зависимость фазы от частоты возбуждения соответственно) (14). Мы определили m c и ζ c свободного кантилевера, F , DC , DCδ и a путем подгонки 1 и 2 с фиксированным значением k c , полученным ранее из тепловой настройки свободного кантилевера (см. рис. S1 во вспомогательных материалах). С молекулой, прикрепленной между кантилевером и подложкой, соответственно изменяются жесткость и трение системы молекула-консоль.По отношению к движению кончика кантилевера это приводит к параллельному механическому расположению (11), где общий зависящий от частоты модуль представляет собой сумму модулей молекулы и кантилевера соответственно. Мы предполагаем, что масса системы кантилевер-молекула неизменна и равна массе свободного кантилевера, m c , так как масса одиночной молекулы пренебрежимо мала (11,13–15). Если мы предположим, что в динамике молекулы миозина преобладают внутренние конформационные перестройки и, таким образом, она имеет одномодовую ответную функцию пружины и рывка параллельно, уравнения. 1 и 2 становятся

A=F{kc+km−mc×(2πν)2}2+(ζc+ζm)2×(2πν)2+DC

(3)

и

δ=tan− 1[(ζc+ζm)×2πνkc+km−mc(2πν)2]+DCδ+aν,

(4)

соответственно. Решение уравнений. 3 и 4 для фиксированной частоты колебаний ν, k м и ζ м даются выражением

km=F(A−DC)1+(tan(δ−DCδ−aν))2 +mc(2πν)2−kc

(5)

и

ζm=mc(2πν)2−(kc+km)2πνtan(δ−DCδ−aν)−ζc.

(6)

Частоту колебаний выбираем равной 22 кГц, что близко к резонансной частоте кантилевера, так как при этой частоте фазовый сдвиг чувствителен к изменению k m или ζ м .Преимущество измерения отклика на одной частоте заключается в том, что это значительно сокращает время, необходимое для получения всего вязкоупругого спектра, что сводит к минимуму эффект пьезодрейфа. Кроме того, здесь это имеет решающее значение, так как время жизни связи между кончиком АСМ и миозином слишком мало, чтобы можно было получить полный частотный спектр для одной молекулы (около 200 мс) (13). Однако это означает, что когда молекулярный отклик более сложен, константы вязкоупругости могут быть завышены.В общем, в реакции молекулы преобладают упругие процессы при низкой частоте ( A ( ω ) ~ F / k m ) и фрикционные процессы при высокой частоте ( A ( ω ) ~ f / ωζ м ), где 1/ k m = Σ I 1/ K I и 1/ ζ M = Σ i 1/ ζ i , где k i и ζ i — константы упругости и трения каждой моды.Таким образом, колебание на одной частоте в каждом из этих режимов даст точную оценку констант упругости и трения.

Длина контура, L , была определена по силе прилегания f по сравнению с данными удлинения x с использованием модели червячной цепи (WLC), ( f = ( k B T p )(1/{4(1 − x / L ) 2 } − 1/4 + x / L )) с фиксированной сохраняемостью p = 0. 4 нм (16).

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

оптических пинцетов показывают, как раскручивается ДНК — ScienceDaily

ITHACA, NY — Используя оптический пинцет для вытягивания отдельных нитей хроматина — ДНК-белкового комплекса, из которого состоят хромосомы — исследователи впервые увидели, как информация в фундаментальных единицах генетической упаковки, называемых нуклеосомами, могут стать доступными для молекул, которые «читают» их.

Доклад физиков и биологов из Корнельского и Массачусетского университетов опубликован в текущих Proceedings of the National Academy of Sciences (Vol. 99, выпуск 4), «Механическое разрушение отдельных нуклеосом выявляет обратимое многоступенчатое высвобождение ДНК». Это первое прямое наблюдение динамической структуры отдельных нуклеосом. Хромосомная ДНК упакована в компактную структуру нуклесомы с помощью специализированных белков, называемых гистонами. Комплекс ДНК плюс гистоны в клетках высших организмов называется хроматином.

Мишель Д. Ванг, доцент кафедры физики Корнеллского университета, возглавлявшая научную группу, сказала, что исследователи предлагают трехэтапную модель того, как нуклеосомные единицы в хроматине открываются, чтобы показать свою ДНК ферментам, таким как РНК-полимераза.

Три стадии стали очевидными, когда нуклеосома была раскручена по мере того, как ДНК растягивалась с возрастающей силой, говорит Брент Брауэр-Толанд, ведущий автор статьи и научный сотрудник Корнеллской лаборатории атомной физики и физики твердого тела. Описывая высвобождение ДНК из одной нуклеосомы, он говорит: «Когда мы тянули отдельное хроматиновое волокно с возрастающей силой, при малой силе сначала высвобождалось 76 пар оснований ДНК на нуклеосому, затем при более высоких усилиях высвобождалось еще 80 пар оснований, а гистоны оставались неподвижными. связывается с ДНК с последующим отрывом гистонов при еще более высоких силах.Но если бы мы высвободили волокно до того, как гистоны были отсоединены, нуклеосомы смогли бы собраться заново, и весь процесс можно было бы повторить. — было известно в течение некоторого времени, — говорит Ван. — Но структурные и биофизические детали системы не были ясны. Нуклеосомы, кажется, стоят на пути процесса передачи генетической информации, который происходит миллионы раз в день в клетках нашего тела.Мы пытаемся понять механический барьер, создаваемый нуклеосомой, и, кроме того, как модифицируется структура нуклеосомы, чтобы расчистить путь для передачи информации».

Исследователи использовали оптический пинцет для изучения барьера, с которым сталкиваются такие ферменты, как РНК-полимераза, которые побуждают ДНК в нуклеосомах откручиваться от гистонов. С одним концом нити нуклеосомной ДНК, прикрепленным к предметному стеклу микроскопа, а другим концом, прикрепленным к синтетической микросфере и оптически захваченным лазерным лучом, исследователи могли точно измерить динамические изменения в силе связи и организации, когда ДНК была вынуждена развернуться от гистонов. .Такие точные измерения и наблюдения за отдельными молекулами недоступны классическим биохимическим методам, которые являются более косвенными и основаны на усредненных результатах, полученных на огромных популяциях молекул.

Под увеличением электронного микроскопа нуклеосомы выглядят как шарики на нитях хроматина. Более внимательное изучение показывает, что бусинки являются фундаментальными организационными единицами генома, встречаясь в среднем через каждые 200 пар оснований вдоль цепей ДНК, при этом 147 пар оснований ДНК обернуты 1.65 раз вокруг восьмичленных кластеров гистоновых белков. Двухцепочечное волокно ДНК одной хромосомы, если его растянуть в прямую линию, будет иметь длину около двух дюймов. Если бы не компактное хранение — отчасти из-за скручивания ДНК в нуклеосомы, которые, в свою очередь, конденсируются в структуры более высокого порядка — два дюйма ДНК были бы слишком длинными, чтобы поместиться внутри клетки. Однако ДНК должна быть деконденсирована, чтобы ее гены можно было прочитать или скопировать.

Биофизики из Корнелла и Университета Массачусетса провели свои эксперименты по «разрушению» фрагментов ДНК длиной 3684 пары оснований, содержащих 17 нуклеосом.Их экспериментальная установка ранее была разработана и использовалась лабораторией Ванга для изучения ферментативного действия РНК-полимеразы при считывании ДНК. В естественном процессе экспрессии генов нуклеосомы представляют собой препятствие для РНК-полимеразы, когда она движется вдоль молекулы ДНК, транскрибируя генетическую информацию для использования клеткой. Считается, что так называемые машины ремоделирования хроматина, совокупность белков, сопровождающих РНК-полимеразу, различными способами помогают преодолевать эти препятствия. Эксперименты Cornell-UMass показали больше о природе и масштабах препятствий, с которыми сталкивается РНК-полимераза и ее окружение.

###Другими авторами статьи являются Кори Л. Смит и Крейг Л. Петерсон из Программы молекулярной медицины Медицинской школы Массачусетского университета; Джон Т. Лис, профессор молекулярной биологии и генетики Корнеллского университета; и Ричард С. Йех, аспирант физики Корнелла. Исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) и следующими наградами: NIH, Премия ученого Деймона Руньона, Премия молодого исследователя Бекмана, Премия научного сотрудника Альфреда П. Слоана и Премия выдающегося молодого ученого Фонда Кека.

Связанные веб-сайты в Интернете:

o Статья PNAS: http://www.pnas.org/cgi/reprint/99/4/1960.pdf

o Комментарий PNAS:

http://www.pnas.org/cgi/reprint/99/4/1752.pdf

o Подробнее об оптических пинцетах:

http://www.news.cornell.edu/Chronicle/99/1.28.99/genomics/wang.html

o Лаборатория Ванга в Корнелле: http://www.physics.cornell.edu/profpages/Wang.html

http://www.pnas.org/cgi/reprint/99/4/1752.пдф

o Подробнее об оптических пинцетах:

http://www.news.cornell.edu/Chronicle/99/1.28.99/genomics/wang.html

o Лаборатория Ванга в Корнелле: http://www. physics.cornell.edu/profpages/Wang.html

Источник истории:

Материалы предоставлены Корнельским университетом . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

Подставки для разматывания

Производитель опор для намотки и размотки может работать с рулонами весом до 6000 фунтов.& доступен в различных моделях. Особенности включают в себя две регулируемые боковые пластины, которые представляют собой самоцентрирующиеся, термообработанные и полированные ролики.

Сертифицированный по ISO 9001:2000 и ISO 14001 производитель лотков для намотки и размотки. Возможности включают круглосуточное обслуживание, консультации по установке, техническое обслуживание оборудования, управление проектами, CAD/CAM с трехмерным твердотельным моделированием и симуляцией, запуск и предварительное тестирование оборудования на месте. Обслуживает автомобильный рынок, включая OEM-поставщиков и автомобильных поставщиков первого уровня. Своевременная доставка.

Изготовление на заказ лотков для намотки и размотки рулонов. Особенности подставок для рулонов включают обработку толстого материала, безопасную загрузку рулона, удержание рулона, встроенный выпрямитель и совместимость с системой заправки. Подставки для рулонов подходят для любого диапазона внутреннего диаметра рулона и широкого диапазона наружного диаметра. Также доступны лотки-правильные машины для рулонов с пандусом для хранения рулонов и комбинациями люльки-правильной машины для рулонов. Материалы включают алюминий, нержавеющую сталь и сталь.Услуги включают проектирование, механическую обработку, изготовление металлов и обработку рулонов.

Производитель опор для намотки и размотки. Доступны люльки диаметром 60 и 72 дюйма. мощность катушки, 230 В, 460 В и 575 В, трехфазное питание, толщина боковой панели 3/4 дюйма и вес 4000 фунтов. до 60 000 фунтов. емкость. Характеристики люльки включают регулируемые боковые пластины, регулируемые вручную съемники для рулонов, дополнительные устройства для сгибания концов рулонов, прижимные рычаги для рулонов, направляющие ролики сепаратора и пневматические опрокидывающие и опускающие желоба.

Дистрибьютор оборудования для обработки рулонов, включая разматывающие люльки. Услуги включают в себя установку «под ключ», обучающие семинары на заводе, консультации по защите пресс-форм, проверки соблюдения требований OSHA, калибровку датчиков нагрузки и помощь в применении.

Производители широкого ассортимента тяжелого и среднего оборудования, оборудования для прессовой подачи и обработки рулонов, включая: пневматические устройства подачи, устройства подачи с сервоприводом переменного тока, устройства подачи проволоки, вытягивающие и механические правильные станки, станки для поперечной резки

Производитель стандартных и нестандартных опор для намотки и размотки.Доступны различные конфигурации питателя-выпрямителя и рулона. Люльки могут обрабатываться для рулонов толщиной до 0,625 дюйма и весом до 40000 фунтов. Особенности включают в себя приводы переменного или постоянного тока с регулируемой скоростью и прижимные ролики с приводом от кластерной шестерни. Доступны люльки с такими опциями, как пандусы для хранения рулонов, внутренние направляющие пластины с электроприводом, узлы прижимных роликов, устройства для снятия/снятия сгиба, моторизованная регулировка направляющей и моторизованная регулировка валков дробилки.

Проектирование и производство тяжелого прессового оборудования, подающих устройств, люлек, катушек, выпрямителей; Возможность восстановления

Производитель оборудования для подачи в пресс, оборудования для обработки рулонов, корректирующих правильных машин и оборудования для производства гибких материалов.

Бренды+

Выравниватели B&K, CoilMate, Dickerman, Rowe

Производители горизонтальных поворотных столов с электроприводом для штамповочных прессов, четырехползунковых, профилегибочных, пружинно-навивочных или проволочно-формовочных машин.

Дистрибьютор оборудования для обработки и обработки рулонов для металлургической штамповки.

Наверх

« вернуться к просмотру категорий просмотр

Поведение бабочек Heliconius при обработке пыльцы: производное поведение при уходе

Введение

Бабочки, потребляющие нектар, вступают в контакт с пыльцой во время посещения цветов.Когда бабочки ищут и потребляют нектар на цветах, пыльца часто прилипает к хоботку, голове или другим частям тела. Однако только бабочки из близкородственных неотропических родов Heliconius и Laparus (Lepidoptera: Nymphalidae) развили метод питания, при котором аминокислоты извлекаются из пыльцевых зерен (Gilbert 1972; Boggs et al. 1981; Estrada and Jiggins 2002). ; О’Брайен и др., 2003). Пыльца как дополнительный источник питания занимает центральное место в их жизненных историях и связана с другими сложными чертами жизненного цикла, такими как увеличенная продолжительность жизни, мутуалистические взаимодействия насекомых и растений, непрерывный овогенез и цианогенез у взрослых особей и личинок (Gilbert 1972, 1991; Boggs et al.1981 год; Энглер и др. 2000 г.; Белтран и др. 2007).

Благодаря высокой питательной ценности пыльцевых зерен, содержащих аминокислоты, белки, полисахариды, липиды и иногда витамины (Baker 1978; Baker and Baker 1986), не может быть сомнений в преимуществах использования пыльцы в качестве источника пищи. Большинство членистоногих, посещающих цветы, потребляют пыльцу путем пережевывания и пережевывания или проглатывают целые зерна пыльцы (например, Simpson 1955; Smith and Mommsen 1984; Crailsheim et al. 1992; Van Rijn and Tanigoshi 1999; Krenn et al.2005, 2008; Момосе 2005; Кароли и др. 2009). Однако бабочкам, у которых есть присасывательный хоботок, служащий для приема жидкости, нужна особая техника, позволяющая использовать питательные вещества пыльцы. Такое поведение называется «питанием пыльцой», а метод получения питательных веществ называется «поведением обработки пыльцы» (Gilbert, 1972), поскольку пыльца не поглощается, а подвергается специальной обработке на внешней стороне хоботка, с помощью которого бабочка извлекает питательные вещества из пыльцевых зерен (Gilbert 1972; O’Brien et al.2003 г.; Кренн и др. 2009).

Бабочки родов Heliconius и Laparus активно собирают пыльцу при зондировании цветка и накапливают ее снаружи базальной трети хоботка (Boggs et al. 1981; Penz and Krenn 2000), где специализированные щетиновидные sensilla сохраняют пыльцевую нагрузку (рис. 1) (Krenn and Penz 1998). Пыльцевая нагрузка впоследствии обрабатывается путем скручивания и разматывания хоботка, которые могут длиться несколько часов (Gilbert, 1972, 1975; Boggs, 1987).Во время такого поведения эти бабочки выделяют жидкость из хоботка, которая неоднократно впитывается и снова выделяется. Аминокислоты извлекаются из пыльцевых зерен и всасываются через проглоченную жидкость (O’Brien et al. 2003). Во время обработки пыльцы пыльцевые зерна повреждаются (Krenn et al. 2009), и их содержимое выбрасывается в экстрагирующую жидкость, которая, как было показано, представляет собой слюну (Eberhard et al. 2009a). После завершения обработки пыльца опадает с хоботка (Gilbert, 1972).Учитывая, что за экстракцию отвечают протеолитические ферменты слюны (Eberhard et al. 2007), обработка пыльцы на хоботке представляет собой необычный пример внеротового пищеварения.

Хотя азотсодержащие компоненты пыльцевых зерен долгое время считались основой для эволюции новых признаков жизненного цикла бабочек Heliconius (Gilbert 1991), эволюционное происхождение поведения обработки пыльцы остается неясным. В этом исследовании движения хоботка при обработке пыльцы у видов Heliconius были описаны с использованием видеоанализа, а движения сравнивались с движениями родственных нимфалидных бабочек, которые подвергались воздействию частиц пыльцы небольшого размера.Известно, что у бабочек-нимфалид загрязнение тела (усиков, хоботка и глаз) мелкими частицами приводит к высвобождению ухаживающего поведения, выполняемого средней частью голени (Jander, 1966). Однако наблюдения за неотропическими бабочками в полевых условиях (Нилик и Линтнер, неопубликованные данные) показали, что хоботковые движения также удаляют мелкие частицы из хоботка и что слюна использовалась для очистки пищевого канала хоботка. Основываясь на этих наблюдениях, мы предположили, что поведение обработки пыльцы является производным поведением по уходу за хоботком, которое позволяет бабочкам Heliconius использовать пыльцу, прилипшую к хоботку, в качестве источника питательных веществ.

Материалы и методы

Анализ процесса обработки пыльцы у

бабочек Heliconius

Видеозаписи процесса обработки пыльцы у бабочек Heliconius из тепличной популяции в Брэкенриджской полевой лаборатории Техасского университета (Остин, США) в Апрель 2008 г. Всего было зарегистрировано 3 часа 40 минут у 5 особей Heliconius cydno (Doubleday 1847) и 6 особей Heliconius melpomene (Linnaeus) (Lepidoptera: Nymphalidae).Перед съемкой эти бабочки добровольно собирали пыльцу с цветков Psiguria (=Anguria) sp. (Куркурбиталес: Cucurbitaceae), растение, известное как основной источник пыльцы для бабочек Heliconius (Gilbert 1972; Boggs et al. 1981; Murawski and Gilbert 1986; Estada and Jiggins 2002; Krenn et al. 2009).

Поведение при уходе за хоботком

Сравнительное исследование движений хоботка проводилось на Тропической исследовательской станции Ла-Гамба в Коста-Рике (8°45′ северной широты, 83°10′ западной долготы; 81 м над уровнем моря) в период с февраля по апрель 2007 г.Разнообразие экосистем и фауна бабочек этого региона описаны Weissenhofer et al. (2008). Бабочки были пойманы сачком в окрестностях станции рядом с Боске-Эскинас (национальный парк Пьедрас-Бланкас).

Движения хоботка были зарегистрированы у четырех видов, питающихся пыльцой: Heliconius hecale (Fabricius), Heliconius sara (Fabricius), Heliconius pachinus (Salvin) и Laparus doris (Linnaeus), а также нимфалиды, не питающиеся пыльцой: Eueides lybia (Fabricius), Dryas iulia (Fabricius) и Anartia fatima Fabricius.От каждого вида было испытано по пять-шесть особей; Всего было записано на видео 39 человек. У всех бабочек хоботковые движения были вызваны загрязнением хоботка мелкими частицами. Стеклянные шарики (диаметром 106 мкм и меньше, Sigma, www.sigmaaldrich.com) помещали на хоботок бабочки с помощью булавки от насекомых в двух последующих испытаниях. Каждую особь подвергали следующей последовательности: (1) бабочку кормили водой в инсектарии за десять минут до каждого испытания; 2) на хоботок помещали стеклянные шарики и регистрировали реакцию в течение 20 мин; (3) хоботок промыли и бабочку выпустили на волю.В ряде случаев, когда бабочка постоянно перемещалась или не реагировала на загрязненный материал, наблюдение прекращали.

Поведенческий анализ

Видеокамера с жестким диском (JVC GZ-MG37E, www.jvc.com) использовалась для записи 20 минут после первых движений рта у каждого человека (N = 50). Все видеоролики были сохранены на внешний жесткий диск в форматах avi AVI и MPEG. Все движения каждой бабочки были проанализированы с использованием программного обеспечения «The Observer XT» (© 2005 Noldus Information Technology) (Noldus 1991).Все бабочки были сняты в боковых или полубоковых проекциях, чтобы обеспечить подробный анализ поведения. Были выделены отчетливые паттерны движений хоботка, т. е. скручивание, разматывание и боковое движение, степени разгибания хоботка, а также выделение жидкости (рис. 2).

Расширения хоботка были закодированы в три категории. В категории (I) хоботок был плотно закручен; проксимальная часть хоботка вытянута меньше, чем диаметр спирали хоботка в полностью закрученном положении (рис.2А) (Видео). В категории II диаметр свободной спирали хоботка превышал диаметр в закрученном положении более чем на четверть (рис. 2Б). В категории III хоботок был более или менее прямо раскручен (рис. 2D).

Мелкомасштабный анализ был проведен на основе 2-минутных записей поведения обработки пыльцы у H. cydno (N = 5) и H. melpomene (N = 6). Эти анализы включали только третью-пятую минуту из всех 20-минутных записей поведения обработки пыльцы, чтобы получить стандартный набор движений хоботка, которые характеризуют естественное поведение обработки пыльцы (рис. 3).В этом подробном поведенческом анализе движения хоботка были разбиты и закодированы в отдельные движения (т. е. скручивание, раскручивание, вверх, вниз) (рис. 3).

Также были закодированы периоды отсутствия движения (т.е. паузы). Паузу определяли, когда весь хоботок не двигался не менее одной секунды. Чтобы избежать потери данных о продолжительности каждого поведения, все движения были закодированы как события состояния в Observer XT с кодом начала и окончания поведения. Набор данных праймеров был экспортирован, и статистические данные были рассчитаны с использованием программного обеспечения SPSS, версия 11.5 системы SAS для Windows 2002. Поскольку бабочки свободно перемещались во время видеозаписи, некоторые особи поворачивались в такое положение, из которого движения хоботка нельзя было наблюдать. Эти периоды времени составляли менее 15 % (за исключением двух особей с примерно 45 %) от общего времени наблюдения и были включены в анализ данных как «ненаблюдаемые движения».

Для сравнения данных использовалась непараметрическая статистика. Значимость сравнений была установлена ​​на уровне p < 0.05 уровень.

Результаты

Поведение при обработке пыльцы

Во время обработки пыльцы особи H. cydno и H. melpomene сидели неподвижно, сложив крылья вверх. Они переместили хоботок, чтобы обрабатывать пыльцу Psiguria sp. цветы, которые прилипли к спирали во время предыдущих походов за кормом (рис. 1). Поведение при обработке пыльцы представляло собой повторяющуюся последовательность частично скручивающихся и разматывающихся движений хоботка (рис. 2А).В то же время слюна выделялась и смешивалась с собранной пыльцой. Повторяющаяся последовательность нескольких движений хоботка, т. е. скручивание, раскручивание, вверх и вниз (рис. 3), регулярно выявлялась в процессе обработки пыльцы у H. cydno и H. melpomene . В зависимости от размера пыльцевой нагрузки хоботок скручивали от полностью скрученного до слабо скрученного положения (эквивалентно категории растяжения I и II). При закручивании количество витков увеличивается, а спираль хоботка становится более тугой.При раскручивании количество витков уменьшается, а диаметр спирали хоботка расширяется. В то же время весь хоботок поднимается вверх в месте соединения с головой, а затем опускается, что приводит к последовательности движений вверх и вниз.

Видео 1.

Движения хоботка при обработке пыльцы у Heliconius cydno . Щелкните изображение для просмотра видео. Скачать видео.

Из-за большого количества пыльцы некоторые экземпляры не могли полностью свернуть хоботок в положение покоя.Они обрабатывали пыльцу в расширении хоботка II категории. Категория расширения хоботка III никогда не наблюдалась во время обработки пыльцы (рис. 4).

Характерный цикл движений хоботка во время обработки пыльцы показан на рисунке 3 в качестве примера мелкомасштабного анализа. Движение хоботка вверх сопровождалось одновременным и быстрым раскручиванием, после чего следовал более длительный период скручивания. Скручивание занимало большую часть общего времени (60.5 %) за 2 мин (N = 11). Быстрое движение хоботка вниз инициировало скручивание хоботка, после чего весь паттерн начинался заново с восходящих разматывающихся движений (рис. 3). Во время разматывающихся движений хоботка внутренние витки соприкасались с внешними витками, и они скользили по пыльцевому грузу, распространяя выделяемую из хоботка слюну.

Циклы движения хоботка в мелкомасштабном анализе показали среднюю частоту 44,4±21,1 раз в минуту для скручивания и разматывания и 45.1±25,9 раз в минуту для движений вверх-вниз (рис. 3). При движении вверх-вниз спираль хоботка поднималась в суставе к голове до 45° над горизонтальной плоскостью, после чего опускалась.

Кроме того, боковое движение хоботка было обнаружено 13 раз в общей сложности 220 минут со средней общей продолжительностью 0,54% за 20 минут видеозаписи поведения обработки пыльцы (рис. 5). При боковом движении степень закручивания оставалась постоянной, но спираль хоботка поворачивалась то влево, то вправо попеременно.

Во время обработки пыльцы наблюдалось выделение слюны. Слюнная жидкость выделялась из проксимальной части и кончика хоботка, образуя густую взвесь пыльцы. Жидкая фракция всасывалась, и снова слюна выделялась и добавлялась к пыльцевой нагрузке.

Между циклами движения, описанными выше, у большинства людей возникали паузы в движении. Паузы наблюдались со средней продолжительностью 4,18 с, что составляло около 16,06% 2-минутного мелкомасштабного анализа.

Движения хоботка после загрязнения стеклянными шариками

Поведение хоботка по уходу включало скручивание и раскручивание, движения вверх-вниз и в стороны (видео). Эти движения были выполнены в различных категориях расширения хоботка (рис. 2). Хоботок иногда раскручивался до полностью вытянутого положения после загрязнения стеклянными шариками (рис. 4).

Кроме того, закрученный хоботок регулярно перемещался в боковые стороны. Это боковое движение состояло из серии повторяющихся поворотных движений влево и вправо.Максимальная продолжительность этих боковых колебательных движений продолжалась до 70 с у A. fatima . Боковые движения никогда не выполнялись при раскрученном хоботке (категория разгибания III).

Во время груминга выделения слюны приводили к влажной поверхности хоботка у большинства наблюдаемых особей. Хотя все наблюдаемые виды бабочек выделяли жидкость из хоботка, только вида Heliconius выделяли достаточно, чтобы образовались четко очерченные капли, которые можно было сосчитать.У видов Heliconius на хоботке одновременно присутствовало 1–3 капли слюны. Laparus doris произвел наибольшее количество капель из всех наблюдаемых видов (в среднем 20,2 капли/20 мин со стеклянными шариками) после заражения хоботком. Самая высокая средняя продолжительность капель наблюдалась у H. pachinus после заражения стеклянными шариками с 54,1 с на 20-минутную видеозапись.

Таблица 1.

Движения хоботка при обработке пыльцы (*) и уход за хоботком.

Поведение при обработке пыльцы и уход за хоботком

Все движения хоботка при обработке пыльцы и уходе за хоботком сравнивались в 20-минутных видеозаписях (рис. 4–6) (таблица 1) и проверялись на наличие жидкости. Все бабочки демонстрировали один и тот же принцип движения хоботка во время обработки пыльцы и ухода за хоботком, включая отчетливые паузы, во время которых хоботок оставался неподвижным, и выделение шалфея.

Независимо от категории питания (PF, NPF) различия между обработкой пыльцы и уходом за хоботком в основном касались (1) степени выдвижения хоботка (рис. 4), (2) пауз в движении и (3) боковых движений (табл. 1).

Иногда хоботок разворачивался в полностью вытянутое положение только во время ухода за хоботком (рис. 4), но никогда при обработке пыльцы.

В процессе обработки пыльцы бабочки Heliconius совершали почти непрерывные движения скручивания и разматывания с небольшими паузами (рис. 5). Паузы в движении характеризовали груминговое поведение бабочек обеих категорий питания (ПФ, НПФ). Продолжительность пауз движения была значительно выше при груминговом поведении бабочек с экспериментально зараженным хоботком по сравнению с поведением обработки пыльцы бабочек Heliconius (табл.1) (Крускал-Уоллис, χ 2 = 24,081, df = 2, p < 0,0001). Паузы в движениях хоботка возникали в основном при свернутом положении хоботка (I категория растяжки). Пауз движения в развернутом хоботке III категории растяжения не наблюдалось. Бабочки

Heliconius продемонстрировали самую короткую общую продолжительность боковых движений при обработке пыльцы (рис. 6). Большая продолжительность бокового движения была обнаружена у всех особей, протестированных со стеклянными бусинами, и была характерна для ухаживающего поведения.Общая продолжительность бокового движения была выше во время ухода за хоботком в обеих группах (бабочки, питающиеся и не питающиеся пыльцой) по сравнению с поведением обработки пыльцы Heliconius (Kruskal-Wallis, χ 2 = 13,240, df = 2, p < 0,001).

Обсуждение

Питание пыльцой у бабочек Heliconius считается ключевой эволюционной особенностью их жизненного цикла (Gilbert 1972, 1991; Brown 1981; Boggs et al.1981 год; Белтран и др. 2007). Эти насекомые собирают пыльцу с цветов, но не глотают ее. Вместо этого бабочки извлекают аминокислоты из пыльцы, разрушая зерна во время обработки пыльцы, которую выполняет хоботок (Krenn et al. 2009). В этом исследовании был проанализирован стереотипный паттерн движений хоботка, возникающий во время обработки пыльцы. Обработка пыльцы характеризовалась непрерывными длительными скручивающими и разматывающими движениями и движениями свернутого хоботка вверх и вниз.Загрязнение хоботка бабочки стеклянными шариками вызывало поведение по уходу за хоботком, которое во многих аспектах похоже на поведение при обработке пыльцы. Имели место скручивающие и разматывающие движения, но при уходе за хоботком регулярно наблюдались паузы движения, боковые боковые движения и раскручивание до полностью вытянутого положения хоботка.

Все бабочки выделяют некоторое количество жидкости во время ухода за хоботком и обработки пыльцы. Однако капли слюны наблюдались только на хоботке бабочек Heliconius и Laparus во время ухаживания.По-видимому, при очень большой пыльцевой нагрузке на хоботок капель жидкости не было видно. Вместо этого жидкость сразу смешивалась с собранной пыльцой во время обработки пыльцы.

Наличие жидкости на кончике хоботка наблюдалось при сборе пыльцы с цветов (Penz and Krenn 2000), а также при обработке пыльцы и стеклянных шариков в первом исследовании питания пыльцой бабочек Heliconius (Gilbert 1972). Недавнее исследование доказало, что эта жидкость — слюна (Eberhard et al.2009а). Установлено, что слюнные железы Heliconius крупнее, чем у других бабочек, питающихся нектаром, и у родственных родов (Eberhard et al. 2009b). Настоящие результаты показывают, что слюна также используется для ухода за хоботком, что может быть эволюционным источником поведения обработки пыльцы. У бабочек Heliconius обнаружена специальная слюнная помпа, служащая для двустороннего тока жидкости в пищевом канале хоботка (Eberhard, Krenn, 2003).Выделение слюны не ограничивается Heliconiinae, а также было обнаружено у бабочек, питающихся фруктами, которые разбавляют высушенный фруктовый сок перед его употреблением (Knopp and Krenn 2003). Точно так же поглощение пирролизидиновых алкалоидов увядающими растениями у Ithomiinae и Danainae (Boppré, 1981, 1983) предположительно связано с выделением слюны из кончика хоботка.

Движения хоботка можно объяснить функциональным механизмом хоботка чешуекрылых (обзор в Krenn 2010). Согласно этой модели, эластичность кутикулы сворачивает хоботок в неплотно закрученную спираль.Дальнейшие извивающиеся движения вызываются сокращениями собственных галеальных мышц в просвете хоботка. Было обнаружено, что у Heliconiinae этих внутренних галеальных мышц особенно много, и они простираются дальше в область кончика, чем у других Nymphalidae (Krenn and Mühlberger 2002; Bauder and Krenn 2009). Движение скручивания и разматывания включает два разных механизма: внутренние галеальные мышцы вызывают скручивание, а эластичность раскручивает хоботок в свободную спираль.Гидравлический механизм отвечает за дальнейшее раскручивание, которое является результатом повышенного давления гемолимфы, создаваемого сжатием насосов ножки в голове бабочки (Schmitt 1938; Bänziger 1971; Krenn 1990; Wannenmacher and Wasserthal 2003). Боковые движения хоботка, вероятно, вызваны альтернативными сокращениями внутренних галеальных мышц в двух половинах хоботка. Подобные боковые движения наблюдались во время сборки хоботка после выхода из куколки (Krenn 1997).Боковые движения характеризуют последнюю фазу сборки хоботка, в которой галеи смещаются относительно друг друга до тех пор, пока соединительные структуры половинок хоботка не заблокируются. Наблюдаемые движения вверх и вниз, вероятно, обусловлены сокращением внешних крыльевых мышц в базальном хоботковом суставе и антагонистической тычковой мышцы (Eastham and Eassa 1955; Krenn 1990, 2000). Последние хоботковые движения регулярно наблюдаются во время зондирующих движений хоботка у всех чешуекрылых (Krenn 1990; Penz and Krenn 2000; Krenn 2008).Таким образом, в принципе, все отдельные движения обработки пыльцы или ухода за хоботком могут выполняться всеми бабочками.

Мы пришли к выводу, что процесс обработки пыльцы у Heliconius и Laparus возник из-за поведения при уходе за телом, аналогичного тому, что наблюдается у других нимфалид, но было изменено (1) утратой бокового изгиба свернутого хоботка, (2) потеря полного разматывания и (3) увеличение периодов движений наматывания и разматывания. Аналогичная гипотеза была предложена для эволюции поведения пчел при сборе пыльцы.У этих насекомых движения ног в первую очередь отвечают за манипуляции с пыльцой (т.е. поглощение, загрузка и выгрузка пыльцы). Было показано, что они представляют эволюционно возникшие ухаживающие движения, похожие на чистящее поведение (Jander, 1976; Michener et al., 1978).

Эволюционное происхождение питания бабочек пыльцой включает поведенческие модификации, такие как уход за хоботком (показано в этом исследовании) и посещение цветов (Penz & Krenn 2000; Krenn 2008), а также морфологические адаптации хоботка (Krenn & Penz 1998) и слюнные железы (Eberhard & Krenn 2003; Eberhard et al.2009б). Какая из этих модификаций возникла первой в эволюции питания пыльцой, до сих пор неизвестно. Однако гипотеза об эволюционном происхождении поведения обработки пыльцы от ухода за хоботком может быть ценным ключом к пониманию загадочной эволюции питания пыльцой. Использование пыльцы позволило бабочкам Heliconius и близкородственным видам Laparus doris войти в новую адаптивную зону в эволюции их жизненных историй.

Рис 1.

Heliconius cydno сидят неподвижно и обрабатывают пыльцу скручивающими и разматывающими движениями хоботка. Свернутое положение хоботка было закодировано как категория удлинения I; (популяция теплиц в полевой лаборатории Брэкенриджа Техасского университета; фото: любезно предоставлено С. Х. Эберхардом). Фигурки высокого качества доступны онлайн.

Рисунок 2.

Движения хоботка в свободно свернутом и развернутом положениях; категории расширения I–III. (A) Схема движения наматывания и разматывания; стрелками показаны направления движений хоботка.У категории I развернутая проксимальная часть хоботка короче диаметра спирали хоботка. (B) Разматывающее движение; стрелки показывают раскручивание хоботка до его полностью вытянутого положения (пунктирная линия). Свободно закрученный хоботок показывает категорию расширения II, а нескрученный хоботок показывает категорию расширения III. (C) Движение вбок. Стрелки указывают боковые движения свернутого хоботка. (D) модель движения вверх и вниз; стрелками показаны движения хоботка вверх и вниз; поднимается и опускается в суставе к голове.Фигурки высокого качества доступны онлайн.

Рисунок 3.

Мелкомасштабный анализ поведения обработки пыльцы у Heliconius cydno . Снимок экрана, показывающий пример 4 секунды из Observer XT. Представлены четыре движения хоботка: скручивание, раскручивание, вверх и вниз. Скручивание и разматывание происходило одновременно с движениями хоботка вверх и вниз. Все движения повторялись четыре раза в одном и том же порядке. Фигурки высокого качества доступны онлайн.

Рисунок 4.

Положение хоботка во время обработки пыльцы при питании пыльцой Бабочки Heliconius (N = II) и во время ухода за хоботком при питании пыльцой (PF) Heliconiini (N = 22) и питании без пыльцы (NPF) ) Нимфалиды (N = 17). Общая продолжительность в процентах наблюдаемых категорий I, II и III выдвижения хоботка на 20-минутную видеозапись. Фигурки высокого качества доступны онлайн.

Рисунок 5.

Продолжительность движений сматывания-разматывания в процентах от 20-минутного видео.Движения закручивания и разматывания длились дольше при обработке пыльцы, чем при уходе (U-критерий Манна-Уитни, Z = -3,591, P <0,0001), нет существенной разницы в продолжительности поведения при уходе за пыльцой между Heliconius (груминг PF) и не- кормление пыльцой Nymphalidae (груминг NPF) (U-критерий Манна-Уитни, Z = 1,785, P = 0,222). ** = очень значимо; н. с. = не существенно. Фигурки высокого качества доступны онлайн.

Рисунок 6.

Продолжительность боковых движений в процентах от 20-минутного видео.Боковые движения выполнялись дольше при уходе за хоботком, чем при обработке пыльцы (U-критерий Манна-Уитни, Z = 3,218, P = 0,003). Не было никакой разницы между питающимися пыльцой (PF) и не питающимися пыльцой (NPF) в поведении ухода (U-критерий Манна-Уитни, Z = -0,71, P = 1,434). ** = очень значимо; н. с. = не существенно. Фигурки высокого качества доступны онлайн.

Благодарности

Мы благодарим Коста-Риканское министерство окружающей среды и энергии, которое любезно предоставило разрешения на исследования.Кроме того, мы благодарим Стефана и Монику Эберхард за помощь в полевых работах и ​​сотрудников Тропической исследовательской станции Ла-Гамба, Коста-Рика, за предоставление прекрасных условий. Мы благодарим Джона Планта (Вена) за проверку английского языка рукописи. Особая благодарность Ларри Э. Гилберту (секция интегративной биологии Брэкенриджской полевой лаборатории Техасского университета в Остине) за его помощь и советы. Использование теплиц в BFL стало возможным благодаря грантам LEG. Это исследование финансировалось Австрийским научным фондом (FWF-Project 18425-B03).

Каталожные номера

1.

ХГ. Бейкер 1978. Химические аспекты биологии опыления древесных растений в тропиках. В: П. Б. Томлинсон , М. Х. Циммерманн , Редакторы. Тропические деревья как живые системы , стр. 57–82. Издательство Кембриджского университета. Google Scholar

2.

Х.Г. Бейкер , И. Бейкер 1986. Возникновение и значение аминокислот в цветочном нектаре. Систематика и эволюция растений 151: 175–186.Google Scholar

3.

Х. Бензигер 1971. Расширение и скручивание хоботка чешуекрылых — новая интерпретация теории артериального давления. Mitteilungen derSchweizerischen entomologischen . Gesellschaft 43: 225–239. Google Scholar

4.

Дж. Баудер , ХВ. Кренн 2009. Muskelanordnung im Rüssel von pollenfressenden und nektrasaugenden Heliconiini (Lepidoptera: Nymphalidae). Entomologica Austriaca 16: 159–160.Google Scholar

5.

М Бельтран , CD Джиггинс , АВЗ Брауэр , Э Бермингем , Дж. Маллет 2007. Имеют ли питание пыльцой, спаривание куколок и стадность личинок единое происхождение у бабочек Heliconius ? Выводы из данных о многолокусной последовательности ДНК. Биологический журнал Линнеевского общества 92: 221–239. Google Scholar

6.

КЛ Боггс , Джей Ти Смайли , ЛЕ. Гилберт 1981. Модели использования пыльцы бабочками Heliconius . Экология 48: 284–289. Google Scholar

7.

М. Боппре 1981. Взрослые чешуекрылые «кормят» увядшими растениями Heliotropium (Boraginaceae) в Восточной Африке. Экологическая энтомология 6: 449–452. Google Scholar

8.

М. Боппре 1983. Царапание листьев — специальное поведение бабочек данаин (Lepidoptera) для сбора вторичных растительных веществ. Экология (Берлин) 59: 414–416.Google Scholar

9.

КС. Браун младший 1981. Биология Heliconius и родственных родов. Годовой обзор Энтомологии 26: 427–456. Google Scholar

10.

К Крайльсхайм , ЛХВ Шнайдер , Н. Храснигг , Г. Бюльманн , У Брощ , Р Гмейнбауэр , Б. Шёффманн 1992. Потребление и использование пыльцы у рабочих медоносных пчел: зависимость от индивидуального возраста и функций. Журнал физиологии насекомых 38: 409–419.Google Scholar

11.

ЛЕС Истхэм , ДА. Эасса 1955. Питательный механизм бабочки Pieris brassicae L. Философские труды Лондонского королевского общества, серия B: биологические науки . 239: 1–43. Google Scholar

12.

С. Х. Эберхард , ХВ. Кренн 2003. Слюнные железы и слюнные насосы взрослых бабочек (Nymphalidae, Lepidoptera). Зооморфология 122: 161–167.Google Scholar

13.

С. Х. Эберхард , Н. Храснигг , К Крайльсхайм , Кренн , HW . 2007. Доказательства наличия протеазы в слюне бабочки Heliconius melpomene (L.) (Nymphalidae, Lepidoptera). Журнал физиологии насекомых 53: 126–131. Google Scholar

14.

SH Eberhard, AL Hikl, CL Boggs, HW Krenn. 2009а. Слюна или отрыгнутый нектар? Что бабочки Heliconius (Lepidoptera: Nymphalidae) используют для питания пыльцой. Анналы энтомологического общества Америки 102/6: 1105–1108. Google Scholar

15.

С. Х. Эберхард , ХЛ Немешкал , ХВ. Кренн 2009б. Биометрические данные об адаптации слюнных желез к питанию пыльцой у бабочек Heliconius (Lepidoptera: Nymphalidae). Биологический журнал Линнеевского общества 97: 604–612. Google Scholar

16.

Х.С. Энглер , Кей Си Спенсер , ЛЕ.Гилберт 2000. Предотвращение выделения цианидов из листьев. Природа 406: 144–145. Google Scholar

17.

С Эстрада , КОМПАКТ ДИСК. Джиггинс 2002. Модели питания пыльцой и предпочтения среды обитания среди видов Heliconius . Экологическая энтомология 27: 448–456. Google Scholar

18.

ЛЕ. Гилберт 1972. Питание пыльцой и репродуктивная биология бабочек Heliconius . Труды Национальной академии наук США 69: 1403 – 1407.Google Scholar

19.

Л.Э. Гилберт . 1991. Биоразнообразие центральноамериканского сообщества Heliconius : модель, процесс и проблемы. В: Цена PW , ТМ Левинсон , Г. В. Фернандес , В. В. Бенсон , Редакторы. Взаимодействие растений и животных: эволюционная экология в тропических и умеренных регионах , стр. 403–427. Джон Уайли и сыновья. Google Scholar

20.

Р. Джандер 1976. Уход за пчелами и манипуляции с пыльцой (Apoidea): природа и эволюция движений передней ноги. Физиологическая энтомология 1: 179–194. Google Scholar

21.

У. Джандер 1966. Untersuchungen zur Stammesgeschichte von Putzbewegungen von Tracheaten. Zeitschrift für Tierpsychologie 23: 799–844. Google Scholar

22.

Ф Каройи , С.Н. Горб , ХВ. Кренн 2009. Улавливание пыльцы влажным ртом: строение и функция ротового аппарата жука-посещателя цветов Cetonia aurata (Scarabaeidae, Coleoptera). Взаимодействие членистоногих и растений 3: 1– 8. Google Scholar

23.

МЦН Кнопп , ХВ. Кренн 2003. Эффективность кормления фруктовыми соками у Morpho peleides (Nymphalidae, Lepidoptera). Журнал поведения насекомых 16: 67–77. Google Scholar

24.

ХВ. Кренн 1990. Функциональная морфология и движения хоботка чешуекрылых (Insecta). Зооморфология 110: 105–114.Google Scholar

25.

ХВ. Кренн 1997. Сборка хоботка у чешуекрылых — последовательность событий, которая случается раз в жизни. Европейский журнал энтомологии 94: 495–501. Google Scholar

26.

ХВ. Кренн 2000. Мускулатура хоботка бабочки Vanessa cardui (Nymphalidae, Lepidoptera): урегулирование спора об отталкивании хоботка. Acta Zoologica (Стокгольм) 81: 259–266. Google Scholar

27.

Х. В. Кренн . 2008. Пищевое поведение неотропических бабочек (Lepidoptera, Papilionoidea). В: A Weissenhofer, W Huber, V Mayer, S Pamperl, A Weber, G Aubrecht, Editors. Естественная и культурная история региона Гольфо-Дульсе, Коста-Рика , стр. 295–304. Stapfia 88, Oberösterreichische Landesmuseen. Google Scholar

28.

ХВ. Кренн 2010. Механизмы питания взрослых чешуекрылых: строение, функции и эволюция ротового аппарата. Ежегодный обзор энтомологии 55: 307–327. Google Scholar

29.

Х. В. Кренн , СМ. Пенз 1998. Ротовые органы бабочек Heliconius (Lepidoptera: Nymphalidae): поиск анатомических приспособлений к поведению при питании пыльцой. Международный журнал морфологии и эмбриологии насекомых 27(4): 301–309. Google Scholar

30.

Х. В. Кренн , Н. Мюльбергер 2002. Плановая анатомия хоботка бабочек (Papilionoidae, Lepidoptera). Zoologischer Anzeiger 241: 369–380. Google Scholar

31.

Х. В. Кренн , Джей Ди Завод , НУ. Щукич 2005. Ротовые органы насекомых, посещающих цветы. Строение и развитие членистоногих 34: 1– 40. Google Scholar

32.

Х. В. Кренн , Б-А Геребен-Кренн , Б. М. Штайнвендер , А. Попов 2008. Цветок, посещающий Neuroptera: ротовой аппарат и пищевое поведение Nemoptera sinuata (Nemopteridae). Европейский журнал энтомологии 105: 267–277. Google Scholar.

33.

Х. В. Кренн , MJB Эберхард , С. Х. Эберхард , А-Л Хикл , В. Хубер , ЛЕ. Гилберт 2009. Механическое повреждение пыльцы способствует усвоению питательных веществ у бабочек Heliconius (Nymphalidae). Взаимодействие членистоногих и растений 3(4): 203–208. Google Scholar

34.

К. Момосе 2005. Опыление жуками в тропических лесах.В: Д. В. Рубик , С Сакаи , Карим А.А. Хамид , Редакторы. Экология опыления и тропические леса, Саравакские исследования. Экологические исследования 174: 104–110. Springer Science + Business Media, Inc. Google Scholar

35.

КД Миченер , М Уинстон , Р. Джандер 1978. Манипуляции с пыльцой и связанные с ними действия и структуры у пчел семейства Apidae. Научный бюллетень Канзасского университета 51 (19): 575–601. Google Scholar

36.

Д. А. Муравски , ЛЕ. Гилберт 1986. Поток пыльцы у Psiguria warscewiczii : сравнение бабочек Heliconius и колибри. Экология 68: 161–167. Google Scholar

37.

LPJJ Нолдус , 1991. The Observer: программная система для сбора и анализа данных наблюдений. Методы исследования поведения, инструменты и компьютеры 23: 415–429. Google Scholar

38.

ДМ О’Брайен , КЛ Боггс , мл. Фогель 2003. Питание пыльцой бабочки Heliconius charitonia : изотопные доказательства переноса незаменимых аминокислот из пыльцы в яйца. Труды Лондонского королевского общества, серия B: биологические науки 270: 2631– 2636. Google Scholar

39.

СМ Пенз , ХВ. Кренн 2000. Поведенческие адаптации к питанию пыльцой у бабочек Heliconius (Nymphalidae, Heliconiinae): эксперимент с использованием цветков Lantana . Журнал поведения насекомых 13: 865–880. Google Scholar

40.

Дж.Б. Шмитт 1938. Механизм питания взрослых чешуекрылых. Разные коллекции Смитсоновского института 97: 1–28. Google Scholar

41.

Дж. Симпсон 1955. Значение присутствия пыльцы в пище рабочих личинок медоносной пчелы. Ежеквартальный журнал микроскопических наук 96: 117–120. Google Scholar

42.

РБ Смит , ТП. Моммзен 1984. Питание пыльцой паука-кругопряда. Наука 226: 1330–1332. Google Scholar

43.

Рейн PCJ Ван , ЛК. Танигоши 1999. Пыльца в качестве пищи для хищных клещей Iphiseius degenerans и Neoseiulus cucumeris (Acari: Phytoseiidae): рацион питания и история жизни. Экспериментальные и прикладные . Акарология 23 (10): 785–802 (18). Google Scholar

44.

Г Ванненмахер , LT. Вассерталь 2003. Вклад верхнечелюстных мышц в движение хоботка у бражников (Lepidoptera: Sphingidae) — электрофизиологическое исследование. Журнал физиологии насекомых 49: 765–776. Google Scholar

45.

Вайссенхофер , В Хубер , В Майер , С Памперль , Вебер , Г. Обрехт 2008. Естественная и культурная история региона Гольфо-Дульсе, Коста-Рика , Stapfia 88, Oberösterreichische Landesmuseen, Линц.{\circ} \mathrm{C} ) в этом температурном интервале?

Стенограмма видео

в этой задаче. Разматывание Т. оксирибонуклеиновой кислоты является реакцией первого порядка. Его активисты сжигают 420 кг камня при температуре 37 градусов по Цельсию. Константа скорости составляет от 4,90 до 10 дней. Супер-минус четыре в минуту. Мы должны переносить его период полувыведения при нормальной температуре тела. Половина жизни призвания. Организм при температуре 40°С. И во сколько раз увеличивается скорость разматывания в этом температурном интервале? Итак, раскручивание обеих ДНК.Ммм. В реакции первого порядка. да. Ага. Наличие активности. Энергия е. равняется двум мм. Ага. Ммм. 420. Убейте формального драгоценного камня. Ммм. Что равно 420 в тендерах на мощность три июля формально При температуре t даже равно двум 37°C, что равно 37 плюс 273 Кальвина Равно 300, затем Гальвин. Ммм. И скорость постоянная. Ага. От заданного равно двум 4,90 за 10 дней. К власти -4 минутная вселенная. Ага. Частично это мы должны вычислить период полураспада. Ага. Ммм. Я скручиваюсь. Ммм. Я слышал 37°С.Что равно Эллен тоже разделить на Кубинское Что равно 0,6 93, разделить на 4,90 на 10 дней. Люди -4 минуты. На словах с помощью Калгари получаем период полураспада равный двум 1,41 за 10 дней. До власти три минуты. Это наш ответ для части E. В части B хорошо. Здесь температура T2 равна 40 градусам Цельсия. Что равно 40 плюс 273 Кельвина, равно двум. 313 Кальвин. Какое красивое допустим като указывает на постоянную скорости мм. Ммм. Температура просто ммм Тито. А температурный интервал Ммм равен двум.Ту минус Стефан, что равно 313 Кальвина — 310 Кальвина. Что равно трем отелам. Хорошо. Ммм. Из нашего уравнения счастья. Ага. О да, мы это знаем. Ой. Ммм. Хорошо. купить Кевина Равного два. Именно к власти он в наше время Ту-11, разделяемый Стивеном Тито. Дефицит ммм. Дали равны два четыре точки 90 в 10 дней. три мощности минус четыре в минуту. Который равен еде, равной силе, равной двум 4 20 за 10 дней три силы 3 драгоценности Постоянная Средняя газовая постоянная, равная 8.314 июля формальный бедный Кальвин. Ммм. Т два равен 300 13 кельвинов. Стивен равен 300 10 карвинам. Да беда. Ммм. Ммм. Ммм. Учитель. Здесь мы получаем Care to equals two. 4.90 за 10 дней. В степени -4 минуты, обратно В восемь дней. В степени 1,562. Итак, мы получаем, что K два равно 2. 2.34 Через 10 дней. В степень -3 минутная обратная. Мы рассчитали это. Венди с помощью калькулятора. Это наш ответ для части B. В части C. Мы должны рассчитать коэффициент, на который скорость разматывания увеличивается в этом температурном интервале здесь.Ага. Температурный интервал равен 23 Кельвина или отдельные города тоже через ДК. Как думаете? Слушать? Ммм. Ммм. Ммм. Ага. Ммм. Хорошо. купить Кевин Равно два 2,34 развлечь эти три силы -3 минуты обратное, разделить на 4,90-10 дней. Чтобы сохранить нашу -4-минутную вселенную. Так что у нас получается делить на кубинское равно два. 4.77. Ммм. То есть К-два равно кубинскому в 4,77 раза. При этом скорость разматывания увеличивается в этом температурном интервале в 4,77 раза. Какие? Ммм мм хм мм. Ага. Большее от вызова увеличивается в четыре раза по совпадению.7 выше трех градусов по Цельсию. Это ммм Да. Ага. Хорошо получается, и если вы хотите сделать это, увеличение на 4 ° C равно 4,77, деленное на см, чтобы получить, что равно 1,5 на девять, увеличение на четыре градуса C. Что почти равно 1,6 мм. Ммм увеличение для очень больных. 1,6 умножить на четыре градуса Цельсия. Это наш окончательный ответ на эту задачу. Ага.

Зависимая от сдвига морфология фактора фон Виллебранда, связанного с иммобилизованным коллагеном | Кровь

Фактор фон Виллебранда (VWF) представляет собой мультимерный гликопротеин, необходимый для адгезии тромбоцитов в местах высокого напряжения сдвига стенки.Хотя его гемостатические свойства тщательно исследованы и определены сайты связывания с гликопротеином Ib (GPIb), гликопротеином IIb-IIIa (GPIIb-IIIa), фактором VIII, коллагеном и гепарином, мало что известно о механизмах его способности стимулировать связывание тромбоцитов. и арест в местах ранений.1 

Мономеры (протомеры) фактора Виллебранда имеют тринодулярную структуру, напоминающую структуру фибриногена, но с совершенно другими молекулярными размерами.2 Протомер длиной примерно 120 нм состоит из 2 глобулярных доменов, соединенных 2 палочковидными доменами и центральным глобулярным узелком. Протомеры собираются в мультимеры различной степени полимеризации (от 2 до более чем 40 протомеров/мультимер), которые в растворе могут иметь различную форму. Чаще всего они имеют спиральную структуру размером примерно от 100 до 300 нм, но иногда в некоторых препаратах также проявляются вытянутые, нескрученные формы.2

VWF в растворе не связывается с нестимулированными здоровыми тромбоцитами в отсутствие модуляторов.Однако тромбоциты прилипают к фактору Виллебранда, связанному с несколькими типами адгезивных белков, и степень этого взаимодействия зависит от скорости сдвига. При высоких скоростях сдвига связывание тромбоцитов в основном зависит от взаимодействия ФВ-ГФИb. 3 Кроме того, очень большое напряжение сдвига может индуцировать зависимую от ФВ агрегацию тромбоцитов даже в отсутствие адгезивных белков. 4 Эти наблюдения показывают, что сдвиг играет важную роль в взаимодействие между VWF и GPIb.

Неясно, претерпевает ли ФВ конформационное изменение при связывании с субэндотелием или коллагеном при высоком напряжении сдвига, или же он одинаково активен при низком и высоком сдвиге с очень высокой скоростью ассоциации-диссоциации с GPIb тромбоцитов и, таким образом, требует нет конформационных изменений, чтобы быть полностью активным.3 Этот последний тип взаимодействия должен сначала значительно снизить линейную скорость тромбоцитов, которые затем могли бы прочно фиксироваться на ФВ через их рецепторы GPIIb-IIIa.3,5 Предыдущее исследование атомно-силовой микроскопии (АСМ) с использованием ФВ, динамически адсорбированного стекло, обработанное октадецилтрихлорсиланом, показало, что VWF может разматываться при сдвиговых напряжениях выше 3,5 Н/м 2 (35 дин/см 2 ).6 

Чтобы исследовать возможные эффекты напряжения сдвига на субмикроскопическую морфологию фактора Виллебранда, мы провели эксперименты по динамическому связыванию покровных стекол, покрытых коллагеном I типа кожи теленка, в перфузионных камерах с параллельными пластинами.Для однозначной идентификации фактора Виллебранда, адсорбированного на коллагене кожи теленка, с помощью АСМ было необходимо специфическое мечение антител, связанных с золотом. Анализ изображений АСМ позволил нам количественно оценить морфологические параметры VWF. Не было обнаружено существенных различий в отношении молекулярной морфологии или ориентации молекул ФВ, связанных с коллагеном, при низкой (0,07 Н/м 2  = 0,7 дин/см 2 ) или высокой (4,55 Н/м 2  = 45,5 дин/см 2 ) напряжение сдвига.

Золь золота получали восстановлением хлорида золота цитратом.7 К 50 мл дистиллированной воды добавляли 1 мл 1% гидрата хлорида золота (содержащего примерно 49% золота; Fluka, Buchs, Швейцария), раствор доводили до кипения, затем добавляли 0,75 мл 1% тринатрия цитрата 2 H 2 O быстро смешивают с перемешиваемой смесью и кипятят с обратным холодильником до тех пор, пока цвет не станет красным. Этот золь, состоящий из частиц диаметром примерно 30 нм, затем охлаждали и титровали до рН = 6,5 0,2 М раствором карбоната калия. Золотые частицы размером около 15 нм были синтезированы путем добавления большего количества (4 мл) цитрата натрия в кипящий раствор хлорида золота.

Для определения количества протеина А, необходимого для стабилизации раствора золота, 100 мкл золя смешивали с увеличивающимся количеством протеина А (Pharmacia, Уппсала, Швеция), растворенного в дистиллированной воде. Через 5 минут во флаконы добавляли 11 мкл 10-кратно концентрированного фосфатно-солевого буфера (10× PBS, содержащий 1,45 М NaCl и 0,2 М фосфата натрия при pH = 7,35) и оценивали изменение цвета через 30 минут стояния.Обычно от 2 до 3 мкг белка А/мл золя золота было достаточно, чтобы стабилизировать частицы от флокуляции, вызванной солью. Чтобы полностью насытить золотые шарики белком, мы обычно добавляли 6 мкг белка А к 1 мл золя, затем к раствору подмешивали водный раствор Tween 20 до конечной концентрации 0,02% для дальнейшей стабилизации комплекса.

Белок А-золото центрифугировали при 10°С в полипропиленовых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл (при 7500 г в течение 11 минут в случае частиц размером 30 нм и при 10 000 г в течение 25 минут для 15-нм золота). ), затем большую часть супернатанта осторожно удаляли, а осадок ресуспендировали в остатке.Концентрированный конъюгат наносили на 5-метровую колонку BioGel A размером 25 × 5 см (BioRad, Hercules, CA) и элюировали PBS, содержащим 0,02% Tween 20 и 0,02% NaN 3 фракциями по 1,5 мл. Вторую, третью и четвертую золотосодержащие (красноватые) фракции сохраняли и объединяли, а остальные фракции отбрасывали. В результате этой процедуры был получен монодисперсный золь без агрегатов. Раствор конъюгата хранился при 4°С без признаков порчи даже через 4 месяца.

VWF был очищен из коммерческого концентрата VWF:FVIII (Haemate P; Centeon Pharma GmbH, Австрия) с помощью гель-фильтрации.Гемат P (2,5 мл) в концентрации 500 мкг/мл ФВ наносили на колонку с сефарозой CL-4B размером 90 × 1,4 см (Pharmacia AB, Уппсала, Швеция), уравновешенную в PBS, и элюировали со скоростью потока 0,5 мл/мл. минуту на фракции по 2,5 мл. Содержание белка во фракциях определяли с помощью реагента на бицинхониновую кислоту (Pierce, Rockford, IL). VWF элюировался вблизи свободного объема колонки. Эти фракции содержали только VWF, что определяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях.Как правило, для экспериментов использовали первые 2 фракции, содержащие только более крупные мультимеры.

Для определения мультимерного распределения фракций VWF был проведен электрофорез в 1,7% агарозном геле SDS параллельно с неочищенным Haemate P и бедной тромбоцитами плазмой человека (смешанный контроль от 5 здоровых доноров). Белки наносили на поливинилидендифторидную мембрану с помощью аппарата для полусухого блоттинга Bio-Rad (Hercules, CA) Trans-Blot SD.Мембрану блокировали 0,5% казеином в PBS в течение 1 часа, затем VWF определяли меченым пероксидазой кроличьим поликлональным антителом против VWF человека (DAKO, Glostrup, Дания) и 3,3′-диаминобензидином. Мультимерный анализ показал, что неочищенный Haemate-P содержит как маленькие, так и большие мультимеры, в диапазоне от димеров до по крайней мере 22-меров, тогда как первые собранные очищенные фракции не содержали более мелких мультимеров.

изображения (4-8 5 × 5 мкм 2 ) были взяты из области сдвига каждого покровного стекла, и морфологический анализ был выполнен с помощью общедоступного бесплатного программного обеспечения UTHSCSA ImageTool (разработанного в Центре медицинских наук Техасского университета в Сан-Антонио). , TX и доступен в Интернете по адресу http://ddsdx.uthscsa.edu/). Поле высот и реконструированные изображения были созданы с помощью бесплатного программного обеспечения gxsm (http://gxsm.sourceforge.net), gnuplot (http://www.gnuplot.org) и Image/J (http://rsb.info. nih.gov/ij/).

Сначала изображения, полученные с помощью АСМ, были бинаризированы с помощью пороговой обработки, чтобы включить только область, покрытую частицами золота. Затем на каждом изображении выполняли удаление фона, чтобы отфильтровать неспецифически связанные золотые шарики: определяли максимальный размер отсечки, чтобы исключить все синглеты, затем (очень немногие) фоновые дублеты удаляли вручную.

Остальные «островки», состоящие из молекул ФВ, покрытых иммунозолотом, были подвергнуты морфологическому анализу по следующим параметрам: площадь ( А ), длина периметра ( Р ), большая ( х ) и длина малой оси ( y ) наиболее подходящего эллипса, угол большой ( α ) и малой оси ( β ) в направлении потока, эксцентриситет ( E  =  x / y ) Округление ( R = 4 πA / p 2), диаметр ферделина ( f = 2 × ( a / π ) 1/2 (соответствующий диаметру круга, имеющего той же площади, что и измеренная частица; более подробное объяснение этих морфологических параметров можно найти в руководстве ImageTool, свободно доступном в Интернете по адресу http://ddsdx.uthscsa.edu), а также процент покрытия поверхности ( C% ). Из этих параметров E и R особенно полезны для определения того, являются ли молекулы VWF продолговатыми и/или дольчатыми, тогда как разброс значений α и β показывает, насколько равномерно ориентированы отдельные молекулы. Чтобы сравнить влияние условий эксперимента с низким и высоким сдвигом на общую морфологию VWF, среднее арифметическое и значения SD были рассчитаны для большинства параметров.

Использование блокирующих агентов для уменьшения неспецифического фонового связывания иммунозолота широко применяется в электронной микроскопии. Однако эти молекулы могут мешать топографии образца в АСМ. Чтобы преодолеть эту проблему, некоторые исследователи вообще избегают блокирования и используют сильно разбавленные антитела за счет низкой эффективности мечения.10 В нашем случае было необходимо получить высокий выход метки при минимально возможном фоновом связывании.Поэтому мы решили использовать блокирующий агент, имеющий малый размер молекулы. Первоначально блокирование перед иммунодетектированием проводили 0,1% Tween 20 в PBS, но эта процедура давала относительно высокий фон. Эксперименты с VWF, нанесенным на нитроцеллюлозную мембрану, показали, что лучшими блокирующими реагентами были 0,5% бычьего казеина в PBS и 0,05% Tween 80 в PBS, однако явное предпочтение отдавалось казеину. Этот последний, выбранный для всех последующих экспериментов, не мешал измерениям АСМ.

В используемых разведениях (1/10× в PBS + 0,05% Tween 20) связанный с золотом белок А очень эффективно метил комплекс ФВ-анти-ФВ; отдельные молекулы были полностью покрыты золотыми шариками (рис. 1А, В). Как и ожидалось, фоновое связывание также было относительно высоким, но его всегда можно было полностью отличить от специфической маркировки, поскольку неспецифически застрявшие частицы золота представляли собой почти исключительно синглеты с очень низким процентом дублетов и практически без более крупных агрегатов (рис. 1С).

Рис. 1.

Эффективность и специфичность мечения фактора Виллебранда методом иммунозолота.

(A) Отдельные молекулы VWF почти полностью покрыты золотыми сферами. VWF, связанный с коллагеном, визуализировали с помощью обработки поликлональными антителами против VWF, а затем с помощью золота, конъюгированного с белком A (шарики диаметром 15 нм). (B) Увеличенная деталь области, ограниченной белым квадратом. (C) Неспецифическое связывание иммунозолота с коллагеном.Перфузированную PBS поверхность коллагена обрабатывали так же, как и предыдущий образец. Хотя на поверхности присутствует несколько маркеров (белая стрелка), эти неспецифически связанные частицы не образуют кластеров и, следовательно, их легко отличить от специфически связанного золота. Коллагеновый слой равномерно покрывает поверхность и образует мелкие нити (черная стрелка). Снимки, полученные в режиме постукивания АСМ, имеют поперечные размеры 5 × 5 мкм (для А и С) или 1 × 1 мкм (В), шкала высот колеблется от 0 до 20 нм (от светлого до темного).Наконечник Ultralever «D», F = 158 кГц, уставка составляет примерно 90% от амплитуды свободных колебаний.

Рис. 1.

Эффективность и специфичность мечения фактора Виллебранда методом иммунозолота.

(A) Отдельные молекулы VWF почти полностью покрыты золотыми сферами. VWF, связанный с коллагеном, визуализировали с помощью обработки поликлональными антителами против VWF, а затем с помощью золота, конъюгированного с белком A (шарики диаметром 15 нм). (B) Увеличенная деталь области, ограниченной белым квадратом. (C) Неспецифическое связывание иммунозолота с коллагеном.Перфузированную PBS поверхность коллагена обрабатывали так же, как и предыдущий образец. Хотя на поверхности присутствует несколько маркеров (белая стрелка), эти неспецифически связанные частицы не образуют кластеров и, следовательно, их легко отличить от специфически связанного золота. Коллагеновый слой равномерно покрывает поверхность и образует мелкие нити (черная стрелка). Снимки, полученные в режиме постукивания АСМ, имеют поперечные размеры 5 × 5 мкм (для А и С) или 1 × 1 мкм (В), шкала высот колеблется от 0 до 20 нм (от светлого до темного).Наконечник Ultralever «D», F = 158 кГц, уставка составляет примерно 90% от амплитуды свободных колебаний.

Во время первых экспериментов на образцах была проведена двойная маркировка золотыми частицами размером 30 и 15 нм, чтобы убедиться, что золотые маркеры действительно видны на поверхности, покрытой коллагеном. Золотые сферы большего размера можно легко найти, но они недостаточно плотно покрывают молекулы фактора Виллебранда, чтобы их можно было действительно использовать для морфологических целей.Однако не было уверенности, можно ли легко различить более мелкие частицы на грубом фоне. Наконец, мы обнаружили, что 15-нм антитела, связанные с золотом, могут быть успешно использованы.

В каждом эксперименте тщательно проверяли целостность коллагенового покрытия, и было обнаружено, что оно всегда образует непрерывный монослой (рис. 1С), равномерно покрывающий поверхность и не смываемый даже после 15 минут перфузии при 4.55 Н/м 2 напряжение сдвига.

Независимо от приложенного напряжения сдвига, фактор Виллебранда, адсорбированный на покрытых коллагеном стеклянных поверхностях телячьей кожи, имел примерно глобулярную или неправильную морфологию (рис. 2), без признаков длинной, прямой, развернутой структуры, описанной ранее6, и без каких-либо специфических ориентации, параллельной или перпендикулярной направлению потока. Хотя с помощью АСМ сложно выполнить точные измерения поперечного размера из-за нелинейных эффектов свертки наконечника — наконечник конечного размера не всегда касается поверхностных элементов своей вершиной, но часто своей стороной; таким образом, кажущийся латеральный размер сканируемых объектов может стать значительно больше, чем в действительности — наиболее вытянутые кластеры всегда состоят не менее чем из 2-х смежных рядов золотых бусин.Это наблюдение предполагает, что ширина лежащей в основе молекулы ФВ не должна быть значительно тоньше 30 нм, учитывая тот факт, что золотые шарики имеют диаметр не менее 15 нм. Это открытие контрастирует с данными Siedlecki et al6, которые визуализировали почти 1000 нм в длину, но очень тонкие, развернутые формы VWF. Используемый нами режим высокого сдвига соответствует примерно 4,55 Н/м 2 ; это значение значительно больше, чем 3,5 Н/м 2 , заявленное как критическое напряжение сдвига, необходимое для частичного разматывания VWF.Однако важно отметить, что некоторые крупные молекулы ФВ неправильной формы присутствовали вблизи края покровного стекла для режима высокого, но не для режима низкого сдвига (рис. 2F).

Рис. 2.

Зависимая от сдвига морфология ФВ, адсорбированного на коллагене.

PBS, содержащий 1 мкг/мл ФВ, перфузировали при 0,07 Н/м 2 (A-C) или при 4,55 Н/м 2 (D-F) напряжения сдвига в течение 5 минут над покровными стеклами, покрытыми коллагеном из кожи теленка.Никаких морфологических различий между образцами, полученными при низких или высоких режимах сдвига, не наблюдается. Двойное мечение 15-нм и 30-нм золото-конъюгированным белком А (черная стрелка указывает на 15-нм золотую бусину, белая стрелка показывает 30-нм золотую частицу). АСМ в режиме постукивания, наконечник микрорычага «F», F = 118 кГц, уставка составляет примерно 90% от амплитуды свободных колебаний. Размеры изображения: 5 × 5 мкм по латерали и 40 нм по высоте.

Рис. 2.

Зависимая от сдвига морфология ФВ, адсорбированного на коллагене.

PBS, содержащий 1 мкг/мл ФВ, перфузировали при 0,07 Н/м 2 (A-C) или при 4,55 Н/м 2 (D-F) напряжения сдвига в течение 5 минут над покровными стеклами, покрытыми коллагеном из кожи теленка. Никаких морфологических различий между образцами, полученными при низких или высоких режимах сдвига, не наблюдается. Двойное мечение 15-нм и 30-нм золото-конъюгированным белком А (черная стрелка указывает на 15-нм золотую бусину, белая стрелка показывает 30-нм золотую частицу). АСМ в режиме постукивания, наконечник микрорычага «F», F = 118 кГц, уставка составляет примерно 90% от амплитуды свободных колебаний.Размеры изображения: 5 × 5 мкм по латерали и 40 нм по высоте.

Результаты, полученные в результате морфологического анализа не менее 4 удаленных полей зрения (5 × 5 мкм), взятых из области потока покровного стекла с низким или высоким сдвигом, представлены в таблице 1. (Для корректности объекты, соприкасающиеся с краями изображения, были исключены при морфологическом анализе.) Эти наблюдения можно было бы повторить в другом подобном эксперименте (таблица 1).Небольшие различия между двумя наборами экспериментов, вероятно, вызваны различиями в остроте наконечника. При сравнении режимов низкого и высокого напряжения сдвига не наблюдалось существенных различий в отношении среднего размера молекулы, средней округлости частиц, среднего эксцентриситета, среднего диаметра Ферета или среднего угла большой оси. Высокие значения SD для этого последнего указывают на то, что молекулы почти случайно ориентированы по отношению к направлению потока. Однако большее количество молекул неправильной формы было обнаружено при высоком напряжении сдвига.Наконец, можно ясно видеть, что покрытие поверхности через 5 минут перфузии ФВ почти в 2 раза больше при высоком сдвиге, чем при низком. Это наблюдение, согласующееся с количественными данными о связывании ФВ с коллагеном при различных условиях сдвига (JH, LN, J. Vermylen и HD, рукопись в стадии подготовки), можно объяснить тем фактом, что проточная камера, используемая для эксперимента с высоким сдвигом, имеет более узкая щель камеры и, кроме того, должна использоваться при более высокой скорости потока (25 мл/мин по сравнению с 10 мл/мин для камеры с низкой скоростью сдвига) для достижения требуемого значения напряжения сдвига стенки, таким образом, большее количество VWF циркулирует по площади сдвига покровного стекла в течение заданного времени перфузии.

Таблица 1.

Морфологические свойства отдельных молекул фактора Виллебранда после 5 минут перфузии 1 мкг/мл фактора Виллебранда поверх коллагена, как определено с помощью анализа цифровых изображений (среднее значение ± стандартное отклонение)

87 ± 88 6 -254
Напряжение сдвига . Первый эксперимент . Второй эксперимент .
0,07 Н/м 2 . 4,55 Н/м 2 . 0,07 Н/м 2 . 4,55 Н/м 2 .
Количество измеренных молекул 210 378 186 336
покрытия поверхности,% 4,06 7,92 4,94 8,04
Средняя площадь, квадрат Pixels 253 ± 180 330 ± 434 279-1577 279 ± 152 314 ± 440
Средний периметр, пиксели 71 ± 38 79 ± 60 74 ± 27
средняя длина основных оси, пиксели 22 ± 11 25 ± 14 25 ± 14 24 ± 8 27 ± 16 27 ± 16 27 ± 16 27 ± 16
Средний угол оси, степени 15 ± 43 10 ± 38 21 ± 34 20-3579 20 ± 35
Средняя длина незначительной оси, пиксели 14 ± 5 ​​ 15 ± 9 15 ± 5 15 ± 8 9097 7
Угол незначительной оси, степени -13 ± 59 -13 — 63 -28-2877 -28 — 59 -25 ± 58
Среднее эксцентриситет 1.67 ± 0,58 1,62 ± 0,42 1,77 ± 0,59 1,83 ± 0,55
Среднее округлости 0,66 ± 0,20 0,67 ± 0,19 0,64 ± 0,14 0,58 ± 0,17
Среднее Фере Диаметр, пиксели 17 ± 6 19 ± 9 18 ± 5 19 ± 8
99 79 ± 60 9 97 ± 88 9 97 ± 88 4 7
Стресс . Первый эксперимент . Второй эксперимент .
0,07 Н/м 2 . 4,55 Н/м 2 . 0,07 Н/м 2 . 4,55 Н/м 2 .
Количество измеренных молекул 210 378 378 186 336 336
Покрытие поверхности,% 4.06 70977 7.92 4.94 8.04 8.04
253 ± 180 330 ± 434 279 ± 152 279 ± 152 314 ± 440
Средний периметр, пиксели 71 79 74 ± 27 87 87 ± 88
Средняя длина основных осей, пикселей 22 ± 11 25 ± 14 24 ± 8 27 ± 16
Средняя основной угол оси, степени 15 ± 43 10 ± 38 21 ± 34 20 ± 35 20 ± 35
Средняя длина незначительной оси, пиксели 14 ± 9 15 ± 9 15 ± 5 15 ± 8 15 ± 8
среднее значение немногих оси, степени -13 ± 59 -13 ± 63 -28-2577 -28-25 ± 58
76 1.67 ± 0,58 1,62 ± 0,42 1,77 ± 0,59 1,83 ± 0,55
Среднее округлости 0,66 ± 0,20 0,67 ± 0,19 0,64 ± 0,14 0,58 ± 0,17
Среднее Фере диаметр, пикс

Если значения округлости молекул VWF отобразить в зависимости от их площади (рис. 3A-D), получаются очень похожие «графики облаков» для режимов с низким и высоким сдвигом.Однако в последнем случае можно было увидеть несколько очень больших молекул неправильной формы (рис. 2F), которые полностью отсутствовали в эксперименте с низким сдвигом.

Рис. 3.

График зависимости округлости молекул VWF от площади в зависимости от напряжения сдвига.

Показаны совмещенные графики, представляющие данные из 4 экспериментов (A,C,E,G: низкий сдвиг; B,D,F,H: высокий сдвиг). После 5-минутной перфузии VWF по поверхности коллагена распределение размера области, покрытой золотыми шариками, одинаково при низком (A, 1-й эксперимент; C, 2-й эксперимент) и при высоком сдвиговом усилии (B, 1-й эксперимент; D, 2-й эксперимент), но некоторые очень большие молекулы присутствуют только в последнем случае (точки справа от B и D).Графики облаков для графиков округлости и площади показывают, что неравномерность молекул VWF, по-видимому, коррелирует с размером их площади, а молекулы с очень неправильной формой также необычно велики. При перфузии в течение 15 минут такие крупные молекулы уже не могли быть обнаружены ни при отсутствии (Е-F), ни при наличии (G-H) фиксированных тромбоцитов в перфузате. Параметры АСМ идентичны параметрам на рис. 1.

Рис. 3.

График зависимости округлости молекул VWF от площади в зависимости от напряжения сдвига.

Показаны совмещенные графики, представляющие данные из 4 экспериментов (A,C,E,G: низкий сдвиг; B,D,F,H: высокий сдвиг). После 5-минутной перфузии VWF по поверхности коллагена распределение размера области, покрытой золотыми шариками, одинаково при низком (A, 1-й эксперимент; C, 2-й эксперимент) и при высоком сдвиговом усилии (B, 1-й эксперимент; D, 2-й эксперимент), но некоторые очень большие молекулы присутствуют только в последнем случае (точки справа от B и D). Графики облаков для графиков округлости и площади показывают, что неравномерность молекул VWF, по-видимому, коррелирует с размером их площади, а молекулы с очень неправильной формой также необычно велики.При перфузии в течение 15 минут такие крупные молекулы уже не могли быть обнаружены ни при отсутствии (Е-F), ни при наличии (G-H) фиксированных тромбоцитов в перфузате. Параметры АСМ идентичны указанным на рисунке 1.

Чтобы определить, вызваны ли различия в покрытии поверхности различиями в скорости массопереноса, была проведена серия экспериментов с более длительным временем перфузии, чтобы свести к минимуму эффекты времени адсорбции.Через 15 минут перфузии не было обнаружено существенных различий в покрытии поверхности (5,7% и 6,0% для скорости сдвига 0,07 Н/м 2 и 4,55 Н/м 2 соответственно). Все исследованные морфологические факторы также идентичны в пределах погрешностей измерения, согласно рассчитанным значениям стандартного отклонения (табл. 2), и, что интересно, очень крупные молекулы, наблюдаемые при 4,55/м 2 , но не при 0,07 NN/м 2 во время предыдущих опытов с 5 минут перфузии отсутствуют.Эти данные дополнительно подтверждают отсутствие существенных различий между морфологией VWF при двух режимах сдвига.

Таблица 2.

Морфологические свойства отдельных молекул ФВ (среднее ± стандартное отклонение) после 15 минут перфузии покровных стекол, покрытых коллагеном, с 1 мкг/мл ФВ

70976 128 ± 93 7 9096 59 ± 32 9096 9096 9 ± 42 76 60954 17 ± 7 80 ± 0,6 9097 6 9
Напряжение сдвига . 0,07 Н/м 2 . 4,55 Н/м 2 .
Количество измеренных молекул 599 896 896
5.7 6.0
182 ± 149
Средний периметр, пиксели 74 ± 45 59 ± 32 20 ± 10 17 ± 7 17 ± 7
Средний угол оси, градусы 4 ± 43 7 ± 42
Средняя длина незначительной оси, пиксели 12 ± 5 10 ± 4
средний угол оси, степени 13 ± 61 3 ± 63
Средний эксцентриситет 1.80 ± 0,6 1.80977 1,80977
Средняя круглая 0,48 ± 0,18 0,50 ± 0,17
Среднее диаметр формы, пиксели 14 ± 5 ​​ 12-20946
Напряжение сдвига . 0,07 Н/м 2 . 4,55 Н/м 2 .
Количество измеренных молекул 599 896
Покрытие поверхности, %7 6.0 6.0
Средняя площадь, квадратные пиксели 182 ± 149 128 ± 93
Средний периметр, пиксели 74 ± 45 59 ± 32 59 ± 32
Pixels 20 ± 10
Средний угол оси, степени — 4 ± 43 7 ± 42
Средняя длина незначительной оси, пиксели 12 ± 5 10 ± 4  
Средний угол малой оси, градусы 13 ± 61 3 ± 63  
Средний эксцентриситет 1,80977 1.80 ± 1.2
0,48 ± 0,18 0,50 ± 0,17
Средний диаметр формы, пиксели 14 ± 5 ​​ 12 ± 4

При изучении вызванного сдвигом воздействия на фактор Виллебранда следует помнить, что в физиологических условиях также присутствуют циркулирующие тромбоциты, лейкоциты и эритроциты.Эти клеточные элементы имеют размеры и особенно массу, значительно превышающие размеры молекул VWF, и, следовательно, обладают более высоким импульсом. Вполне возможно, что дрейфующие тромбоциты, мгновенно взаимодействующие с мультимерами ФВ через их рецепторы GPIb, будут воздействовать на эти мультимеры большими силами, и эти силы будут способны «вытягивать» ФВ и изменять его морфологию гораздо легче, чем одно напряжение сдвига жидкости. Если бы эта гипотеза была верна, можно было бы ожидать, что перфузия в присутствии тромбоцитов должна легко модифицировать морфологию отдельных молекул фактора Виллебранда при высоком сдвиговом напряжении по сравнению с низким.

Таким образом, мы провели 15-минутную перфузию в присутствии 1 мкг фактора Виллебранда и 68 × 10 6 /мл промытых, фиксированных в формоле тромбоцитов. Без фиксации тромбоциты будут прикрепляться к коллагеновому слою через свои рецепторы GPIba-IIa и/или GPVI или образовывать постоянные связи с ФВ с помощью интегринов GPIIb-IIIa. Сам по себе GPIb, по-видимому, не поддерживает прочную адгезию тромбоцитов к фактору Виллебранда; вместо этого клетки, экспрессирующие только этот рецептор, катятся по поверхности, тогда как связи постоянно восстанавливаются и разрываются.5,11 

Используемое низкое количество тромбоцитов не оказывает существенного влияния на вязкость перфузата. Перед перфузией проверяли функциональность тромбоцитов с помощью ристоцетинзависимой реакции агглютинации тромбоцитов. Фиксированные тромбоциты, смешанные с 1 мкг/мл фактора Виллебранда в PBS, медленно агрегировали в небольшие агрегаты при добавлении ристоцетина (конечная концентрация 1,5 мг/мл), что означает, что рецепторы GPIb были по крайней мере частично активны.Тромбоциты не прилипали к коллагену, что указывает на то, что рецепторы коллагена больше не активны из-за фиксации.

При перфузии измеренные морфологические параметры, перечисленные в Таблице 3, не указывали на какое-либо изменение формы ФВ при скорости сдвига 6500/с по сравнению со скоростью 100/с (из-за присутствия тромбоцитов, вязкости жидкости; таким образом, значения напряжения сдвига в этих случаях несколько выше, чем в PBS, содержащем только 1 мкг/мл ФВ).Кроме того, покрытие поверхности VWF было выше при низком, чем при высоком напряжении сдвига, что противоположно тому, что было обнаружено в двух 5-минутных экспериментах по перфузии. Это наблюдение дополнительно подтверждается графиками площади округлости (рис. 3G, H).

Таблица 3.

Морфологические свойства отдельных молекул ФВ (среднее значение ± стандартное отклонение) после 15 минут перфузии с 1 мкг/мл ФВ и 68 × 10 9 /л фиксированных промытых тромбоцитов

9096 63 ± 32 6
Напряжение сдвига . > 0,07 Н/м 2 . > 4,55 Н/м 2 .
Количество измеренных молекул 795 534 534 9
7.8 4,5
180 ± 143 177 ± 130
средний периметр, пиксели 67 ± 42 63 ± 32
средняя длина основной оси, пикселями 20 ± 9 19 ± 8 19 ± 8
Средний угол оси, степени 10 ± 40 — 1 ± 39 — 1 ± 39
Средняя длина незначительной оси, пиксели 12 ± 5 12 ± 5 12 ± 5
Средний угол оси, степени 5 ± 62 3 ± 64
Средний эксцентриситет 1.72 ± 0,48 1,72 ± 0,50
Среднее округлости 0,56 ± 0,18 0,60 ± 0,17
средний диаметр Фере, пиксели 14 ± 5 ​​ 14 ± 4
7 6 — 1 ± 39
Напряжение сдвига . > 0,07 Н/м 2 . > 4,55 Н/м 2 .
Количество измеренных молекул 795 534
Покрытие поверхности, %8 4.5 4.5
Средняя площадь, квадратные пиксели 180 ± 143 177 ± 130
67 ± 42 67 ± 42 63 ± 32
Средняя длина основной оси, Pixels 20 ± 9 19 19 ± 8
Средний угол оси, степени — 10 ± 40 — 1 ± 39
средняя длина незначительной оси, пиксели 12 ± 5 12 ± 5  
Средний угол малой оси, град 5 ± 62 3 ± 64  
Средний эксцентриситет 972 ± 0,48 1,72 ± 0.50
Средняя округлая 0.56 ± 0,18 0,60 ± 0,17
Средний диаметр формы, пиксели 14 ± 4 14 ± 4

Мы изучили морфологию фактора Виллебранда, связанного с иммобилизованным коллагеном I типа кожи теленка, при сдвиговом напряжении 0,07 Н/м 2 (низкий сдвиг) и 4.55 Н/м 2 (высокий сдвиг), с использованием перфузионных камер с параллельными пластинами и АСМ.

Основная трудность в морфологических экспериментах, проведенных на ФВ, связанном с поверхностью коллагена с помощью АСМ, заключается в неравномерной топографии слоя коллагена, что затрудняет, если вообще делает невозможным, отличить коллаген от связанного ФВ с помощью прямых топографических измерений. Эта трудность может быть преодолена путем мечения VWF иммунозолотом, поскольку тщательно подобранные размеры золотых маркеров могут быть однозначно идентифицированы с помощью АСМ, тогда как они имеют достаточное латеральное разрешение для количественной работы даже на гофрированных поверхностях, таких как целые клетки.12-15 Иммунозолото уже успешно применялось для мечения фактора Виллебранда либо для электронной микроскопии,16,17, либо для АСМ.10 В нашем случае необходимо было разработать специфическую процедуру иммунозолота, которая позволяет проводить высокоэффективное мечение с приемлемым уровнем неспецифического фона.

Поскольку эффект фактора Виллебранда на остановку тромбоцитов, в отличие от фибриногена, становится значительным только при высоких скоростях сдвига,1 широко распространено мнение, что это явление может быть связано с морфологическими или конформационными изменениями молекулы фактора Виллебранда, вызванными напряжением сдвига.(Мы считаем важным различать морфологические и конформационные изменения, поскольку первое относится к форме мультимерной молекулы, тогда как термин «конформационное изменение» предполагает модификацию трехмерного расположения ее аминокислотного остова на гораздо меньших масштабах.) Из предыдущих исследований известно, что некоторые фрагменты ФВ, в которых изменен домен А1, демонстрируют либо повышенное, либо пониженное связывание с GPIb.18,19 ФВ может претерпевать изменение формы в определенных условиях: при нагревании до 55 °С, ФВ разворачивается и растягивается без видимой потери антигенности и степени мультимеризации молекулы.17 Считается, что эта форма обладает повышенной способностью поддерживать адгезию тромбоцитов. Более того, различные (глобулярные и линейные) морфологические формы Виллебранда можно было визуализировать либо с помощью электронной микроскопии2, либо с помощью АСМ. продемонстрировали существование длинных разветвленных молекул среди преобладающих глобулярных форм, когда напряжение сдвига превышало пороговый предел в 3,5 Н/м 2 . Этот эксперимент, по-видимому, подтверждает гипотезу о вызванных сдвигом модификациях трехмерной структуры VWF, но используемый субстрат был искусственным (самособирающийся монослой октадецил-трихлорсилана на стекле, разработанный для обеспечения оптимально плоской поверхности для прямого наблюдения за белками). молекулы) и не обязательно обладает такими же свойствами по отношению к фактору Виллебранда, как его естественные связывающие субстраты, адгезивные белки, обнаруженные в субэндотелиальных матриксах, таких как коллагены.Кроме того, кажется, что сама форма молекулы также может зависеть от свойств поверхности.20

Наши данные не подтверждают вызванное сдвигом морфологическое изменение фактора Виллебранда. Хотя используемое высокое напряжение сдвига было явно больше, чем пороговое значение во время экспериментов Siedlecki et al6 (4,55 Н/м 2 против 3,5 Н/м 2 ), не было обнаружено существенных различий в отношении всех изученных средних морфологических параметры.Развертывание молекул приведет к увеличению среднего эксцентриситета и уменьшению средней округлости или к тому и другому. Кроме того, ожидается, что молекула, становящаяся нитевидной под напряжением сдвига, будет ориентироваться в направлении сдвига, то есть параллельно потоку в нашей экспериментальной установке. Опять же, такое наблюдение не могло быть сделано.

Эти соображения основаны на предположении, что одной силы сдвига жидкости достаточно, чтобы «вытянуть» молекулы VWF в удлиненную морфологию.Не исключено, что даже если физиологическое напряжение сдвига не способно вызвать такие изменения, взаимодействие с дрейфующим тромбоцитом (имеющим относительно высокий импульс) может проявить достаточную силу, чтобы раскрутить молекулу. Мы не обнаружили такого эффекта при использовании фиксированных промытых тромбоцитов, но это само по себе не является убедительным доказательством, поскольку фиксация изменяет гибкость тромбоцитов, а также инактивирует несколько рецепторов клеточной поверхности, которые могут потребоваться для осуществления этого взаимодействия.

Остается возможность того, что VWF «откатится» в свою неактивную морфологию, когда напряжение сдвига прекратится.Чтобы избежать этого эффекта, первые 3 минуты фиксации всегда выполнялись при наличии сдвига. По прошествии этого времени маловероятно, что белок, стабилизированный перекрестными связями, сможет отскочить. Кроме того, зависимое от сдвига морфологическое изменение фактора Виллебранда, описанное ранее, наблюдалось вне потока примерно через 5 минут после того, как покровное стекло было снято с устройства для срезания.6

Однако более крупные мультимеры ФВ более активны в стимулировании адгезии тромбоцитов9, и некоторые необычно большие молекулы присутствовали в режиме высокого сдвига, когда перфузия выполнялась в течение 5 минут.Эти молекулы также имели довольно дольчатую форму, что может соответствовать морфологическим изменениям, вызванным сдвигом. Однако важно отметить, что (1) все молекулы VWF имеют тенденцию становиться более дольчатыми с увеличением площади поверхности, как показано на рисунке 3, независимо от режима сдвига; (2) мы не знаем, раскручивались ли эти неправильные большие молекулы при связывании с поверхностью, или они уже имели менее компактную форму в растворе; (3) площадь, занимаемая крупнейшими мультимерами, все еще мала по сравнению с общей площадью, покрытой ФВ; и, наконец, (4) у этих крупных молекул отсутствует какая-либо определенная ориентация по направлению потока, как у более мелких.Кроме того, такие большие молекулы не обнаруживались при увеличении времени перфузии до 15 минут. Мы не знаем, связано ли это последнее явление с опосредованным сдвигом отслоением фактора Виллебранда. Предыдущие наблюдения показали, что тромбоциты, уже прикрепленные к поверхности, могут отделяться от нее под действием сил сдвига, особенно если они еще не претерпели изменения формы. 21 Фактически, самые большие мультимеры VWF предпочтительно обнаруживались ниже по течению. Хотя прямых доказательств, подтверждающих следующую гипотезу, нет, не исключено, что под действием сил сдвига эти молекулы фактора Виллебранда перемещались бы на коллаген.Таким образом, хотя VWF перфузируется по поверхности, более крупные мультимеры будут продвигаться медленным движением в направлении потока. Когда раствор VWF заменяется PBS, а затем параформальдегидом, эта транслокация будет продолжаться до тех пор, пока перекрестное связывание с матрицей через связи, индуцированные формальдегидом, окончательно не зафиксирует молекулы. В течение времени, необходимого для того, чтобы произошла эта сшивка, мультимеры вблизи выхода могли ускользнуть, тогда как те, что вверх, должны были сместиться в направлении заднего края покровного стекла.Даже если обычно считается, что более крупные молекулы более эффективно связываются с поверхностью, чем более мелкие, из-за их многочисленных мест закрепления, не полностью прикрепленная большая молекула, боковые ответвления которой находятся далеко от поверхности, может быть более склонной к сдвигу. — индуцированная отслойка. Эта гипотеза не противоречит наблюдениям, сделанным предыдущими исследователями на силанизированной поверхности: связывание фактора Виллебранда с этим последним типом матрицы является прочным6, по-видимому, сильнее, чем с коллагеном кожи теленка, о чем свидетельствует тот факт, что 5 минут перфузии буфером, содержащим только 50 нг/мл фактора Виллебранда обеспечивает относительно высокое покрытие поверхности октадецилтрихлорсилана; в то время как на коллагене кожи теленка мы никогда не получали покрытие более 10% поверхности, даже при 1 мкг/мл фактора Виллебранда.

Наши наблюдения, по-видимому, не подтверждают значение модификаций формы VWF, вызванных сдвигом. Это наблюдение не исключает того, что сдвиг действительно оказывает сильное влияние на взаимодействие VWF-GPIb. Определенные мутации с усилением функции домена A1 VWF могут изменять его конформацию, 22 и это изменение может объяснить повышенную авидность модифицированного домена VWF по отношению к GPIb. Хотя зависимость от сдвига связывания тромбоцитов с этими фрагментами была уменьшена по мере того, как увеличивалась их статическая GPIb-связывающая способность, не исключено, что силы сдвига могут быть причиной подобных конформационных изменений.Во всех случаях масштаб этих событий явно меньше разрешения реальных методов АСМ. Однако также наблюдалось усиленное связывание VWF с рекомбинантными цепями GPIbα, когда глицин 223 GPIb мутировался в валин.23 Таким образом, нельзя исключать возможность того, что силы сдвига могут действовать даже на GPIb.

Данные, полученные во время наших экспериментов, склоняются в пользу гипотезы о конститутивном, быстром взаимодействии скорости включения-выключения между VWF и GPIb22,24, а не об индуцированном сдвигом морфологически зависимом увеличении сродства к GPIb.По крайней мере, не было обнаружено существенных различий в общей морфологии отдельных молекул ФВ, подвергавшихся воздействию высоких и низких сдвиговых усилий. Кроме того, вероятность «отката» ФВ после перфузии была небольшой благодаря выполнению промывки и частичной фиксации в потоке. Хотя это ни в коем случае не является окончательным доказательством, маловероятно, что обычно большие зависящие от сдвига различия в эффекте фактора Виллебранда на связывание тромбоцитов можно объяснить наличием некоторых редких нерегулярных и более крупных мультимеров, обнаруженных в ходе 5-минутных экспериментов по времени перфузии (дополнительно, эти более крупные мультимеры отсутствовали при перфузии в течение 15 минут).

В заключение, наши эксперименты не показали значительного общего изменения морфологической формы молекул фактора Виллебранда, связанных с коллагеном, при высоких усилиях сдвига, даже если в определенных условиях наблюдались некоторые большие молекулы неправильной формы. Это не исключает возможного влияния сдвига на один или несколько доменов VWF, но такие мелкомасштабные изменения не могут быть изучены обычными методами АСМ. Наши результаты также подтверждают гипотезу о конститутивном взаимодействии между доменом A1 VWF и GPIb тромбоцитов.

Мы благодарим Andrea Sümegi за PAGE-SDS VWF в восстанавливающих условиях, а также докторов Tamás Bistey, Péter Nagy, György Vámosi и Attila Jenei за их помощь в измерениях с помощью атомно-силовой микроскопии.

Поддерживается OMFB Tét B-13/96; БИОМЕД ERBMC20C980207; и ОТКА Т 022520.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *