Схема простой сигнализации: Простая сигнализация для дома, дачи, гаража — своими руками

Abstract

Живые клетки развили широкий спектр сложных сигнальных реакций, которые позволяют им выживать в различных условиях окружающей среды и выполнять определенные физиологические функции. Наше все более сложное понимание молекулярных механизмов клеточных сигнальных сетей у эукариот выявило удивительно модульную организацию, и синтетические биологи изучают, как это можно использовать для создания клеток с новым сигнальным поведением.Этот подход начинает раскрывать логику того, как клетки могут развивать инновационные новые функции, и подталкивает нас к захватывающей возможности создания пользовательских клеток с точными функциями восприятия и реакции, которые могут быть полезны в медицине и биотехнологии.

Ключевые слова: передача сигналов клеток, инженерия, синтетическая биология, терапевтический, MAP-киназа, каркас, модули, белковые взаимодействия, N-WASP, рецепторы, GPCR, Notch, RTK, рак, адоптивная иммунотерапия, химерные антигенные рецепторы, Т-клетки. , оптический контроль, биопродукция

Живые клетки — это высокодинамичные системы, которые используют сложные молекулярные сигнальные цепи для мониторинга внешнего и внутреннего состояния и выполнения соответствующих физиологических реакций. Как и любая сенсорная машина, созданная или созданная человеком, эти клеточные сигнальные цепи содержат подсистемы принятия решений, которые действуют как сенсоры и процессоры (например, рецепторы и их последующие эффекторы), которые в конечном итоге контролируют различные подсистемы ответа (такие как транскрипция генов и динамика цитоскелета) ( ). Основная цель современной клеточной биологии — понять, как эти молекулярные сигнальные системы достигают своих сложных ответов, которые оптимально настроены для их физиологической роли. Хотя подавляющее большинство исследований нацелено на анализ, картирование и анализ сигнальных сетей клеток, наше растущее понимание того, как работают эти системы, привело к появлению радикально нового подхода — усилий по разработке и созданию собственных синтетических сигнальных цепей [1,2 ].

a | Клетки обычно воспринимают стимулы окружающей среды через рецепторы и другие датчики . Затем эта информация обрабатывается внутриклеточными сигнальными сетями, которые, в свою очередь, задействуют различные клеточные продукты, включая экспрессию генов, секрецию, изменения цитоскелета и рост клеток.

b | Некоторые из основных проблем в развитии или разработке новых сигнальных цепей: : достижение правильной связи определенных входов и конкретных выходов; настройка количественного поведения сигнального ответа — доза-реакция и динамика — так, чтобы они были оптимальными для физиологической функции; и создание устойчивых пространственно самоорганизующихся процессов, таких как процессы, связанные с поляризацией клеток, направленной подвижностью, делением клеток и компартментализацией клеток.

Здесь мы сосредоточимся на синтетической биологии передачи сигналов и посмотрим, как можно спроектировать сигнальные схемы эукариотических клеток для создания клеток с заданным поведением передачи сигналов. Эукариотические клетки используют сети сигнальных белков, чтобы ощущать окружающую их среду и обеспечивать быстрые ответы. Поскольку сети обработки сигналов в клетках функционируют в трехмерном пространстве, они также контролируют сложные пространственные или морфологические клеточные реакции. Мы рассмотрим, как могут быть созданы сигнальные цепи с точным поведением реакции, учитывая, как определяется специфичность ответа (то есть, какие наборы выходных сигналов связаны с конкретным входом), как точно настроенная доза-реакция или временная динамика профили ответов оптимизированы для конкретных физиологических функций и того, как можно достичь сложного пространственного и морфологического контроля ().Мы также рассмотрим, почему появились усилия по разработке и созданию специализированных синтетических сигнальных цепей, как они могут обеспечить более глубокое видение принципов и механизмов разработки молекулярных сигнальных систем и как индивидуализированные реакции на поведение могут быть применены в медицине и биотехнологии. Наконец, мы рассматриваем, как в будущем могут быть разработаны инструменты и методы, которые упростят разработку клеточного поведения.

Почему инженерная сигнализация ячейки?

Прежде чем рассматривать конкретные примеры сконструированных сигнальных путей, полезно обсудить мотивацию инженерии клеточной сигнализации.Попытка создать новое сигнальное поведение в клетках может показаться смелой и глупой целью, учитывая, что у нас еще нет полного или надежного предсказательного понимания естественных сигнальных цепей клеток. Однако разработка клеточной сигнализации — это не просто процесс применения уже хорошо разработанного понимания, но она предлагает подход к «пониманию через построение». В то время как биология традиционно была наукой анализа и деконструкции для выявления генов и молекул, которые важны для конкретного процесса, синтетическая биология предлагает обратный подход, фокусируясь на том, как отдельные молекулярные части могут быть собраны в системы, которые выполняют сложное поведение.Поскольку в настоящее время у нас есть полностью секвенированные геномы и огромное количество протеомных данных, нам не хватает не полного списка молекулярных частей, а скорее понимания того, как эти части сочетаются друг с другом функционально согласованным образом. Разработка новых сигнальных сетей клеток предлагает нам подход к тестированию и расширению нашего понимания принципов организации сложных молекулярных систем.

В этом смысле синтетическая биология передачи сигналов не просто ориентирована на достижение цели приложения, такой как построение клетки с целевой функцией, но также является исследовательской наукой, в которой важно понимать, какие конструкции «работают». и как они соотносятся с «неработающими» дизайнами.Если, например, у кого-то есть естественная сигнальная сеть, которая выполняет сложное представляющее интерес поведение, традиционная генетическая деконструкция может использоваться для идентификации молекул и связей, которые необходимы и важны для функции (). Однако затем можно использовать синтетические подходы для систематического изучения многих типов изменений — альтернативных сетевых связей, настройки силы связей, добавления новых связей — для проверки того, какие сети совместимы с этим интересующим поведением. Анализируя естественную сеть или проектируя единственную успешную схему, вряд ли можно получить более глубокое понимание функционального ландшафта, которое может дать более полное и систематическое исследование синтетической схемы () [3–5]. В этом смысле попытки спроектировать клеточное поведение сродни ранней истории синтетической органической химии, где синтез новых или модифицированных молекул обеспечил дополнительный подход к химическому анализу в развитии фундаментальных теорий химической связи, структуры и реакционной способности [ 6]

и | понимание принципов дизайна. Традиционно для анализа сигнальной сети используются такие методы, как нарушение гена.Синтетические подходы предлагают дополнительную информацию, создавая альтернативные версии сети, которые различаются как подключением к сети, так и мощностью каналов. Сопоставляя пространство функциональных (красные кружки) и нефункциональных (синие кружки) вариантов, можно получить более глубокое понимание функциональных требований.

b | конструирует дизайнерские сигнальные пути для терапевтических или биотехнологических приложений. Мы надеемся собрать набор сигнальных модулей, которые можно использовать для создания ячеек со спроектированными сигнальными ответами.Противораковая клетка может обнаруживать комбинацию сигналов опухоли и давать такие ответы, как выработка реагентов для визуализации, уничтожение клеток или секреция факторов, нарушающих микросреду опухоли. Такая ячейка может также иметь предохранительные выключатели, которые могли бы отключить ячейку при необходимости. Иммуносупрессивная клетка может обнаруживать комбинацию аутоиммунного ответа или сигналов отторжения трансплантата и запускать локальные контрмеры, такие как секреция противовоспалительных цитокинов. Интеллектуальная биопродуктивная (ферментационная) клетка будет спроектирована так, чтобы точно модулировать поток роста по сравнению с производственными путями в ответ на стрессовое состояние клетки, тем самым оптимизируя общий урожай.

Изучение пластичности сигнальных путей и того, как их функции могут быть настроены, также имеет отношение к патологии и лечению заболеваний. Многие виды рака обладают онкогенными мутациями, которые эффективно «переплетают» сигнальные сети клеток, контролирующие баланс между ростом, дифференцировкой и гибелью клеток [7]. Точно так же многие внутриклеточные патогены, включая бактерии и вирусы, производят специфические белки, которые «переплетают» эндогенные сигнальные пути [7]. 8–10]. Многие белки бактериальных патогенов, которые взаимодействуют с клеточной сигнальной киназой и путями регуляции актина, часто для подавления иммунного ответа хозяина или усиления инфекции (см. Дополнительную вставку 1).Таким образом, используя синтетическую биологию для понимания пластичности путей и того, как их поведение изменяется из-за сетевых возмущений, мы можем получить лучшую основу для понимания стратегий, которые патоген принимает для использования внутренней уязвимости сигнальных сетей. Более того, мы можем разработать стратегии для возврата больной сети к стабильному, непатологическому поведению. Наиболее стабильные методы лечения на основе сети могут включать не просто блокировку первичного онкогенного белка лекарством, а изменение структуры сети таким образом, чтобы она располагалась в новой и стабильной области поведенческого пространства.

Применение инженерной передачи сигналов в терапии и биотехнологии

Еще одним мотивом для разработки сигнального поведения клеток является возможность конструирования клеток, запрограммированных для выполнения точно разработанных приложений (). Представьте себе, если бы мы могли имитировать и превзойти эволюцию, используя набор молекулярных компонентов для генетической инженерии клеток, которые выполняют индивидуально разработанные реакции. По мере развития биологии стволовых клеток [11–12] и развития таких методов, как адоптивная иммунотерапия [13–14], возможность использования клеточной терапии становится все ближе, но это потребует сложной клеточной инженерии для точного контроля поведения клеток.Например, без нового контроля, как может быть направлена ​​правильная миграция и дифференцировка стволовых клеток для регенеративной медицины при отсутствии нормальных сигналов развития? Более того, по мере того, как все больше промышленных производственных процессов задействуют биологические организмы (такие как производство биотоплива или материалов) [15], может появиться возможность разработать более разумные производственные штаммы, которые, как и макроскопические производственные объекты, будут иметь системы клеточного контроля, которые отслеживают внешние и внутренние состояния для оптимизации производство.Это может быть особенно важно, поскольку мы просим ферментирующие организмы, такие как дрожжи, производить широкий спектр материалов, которые могут оказывать токсическое действие.

Разработанные противораковые клетки

Если мы сосредоточимся на разработке индивидуальных терапевтических клеток, которые могут воспринимать сигналы болезни и выполнять целенаправленные и точно откалиброванные терапевтические программы, какое поведение мы хотели бы? Иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты или естественные клетки-киллеры, можно модифицировать для идентификации и уничтожения опухолевых клеток.Такие клетки уже можно удалить у пациентов, генетически модифицировать, размножить ex vivo и адаптивно перенести обратно пациенту [16-17]. Противораковая клетка может быть разработана для обнаружения комбинации сигналов, связанных с опухолью, включая специфические опухолевые антигены, гипоксию, органоспецифические антигены, а также специфические факторы роста и цитокины, которые секретируются опухолями, чтобы избежать нормальных иммунных ответов и создать микроокружение, способствующее развитию опухолей [18],. Инженерные клетки, которые распознают эти факторы, но связаны с противоопухолевым ответом, были бы идеальными.Также критически важно разработать внешний контроль (например, небольшую молекулу) или предохранительные переключатели для этих терапевтических клеток, чтобы их поведение можно было отключить или ослабить в ответ на нежелательные побочные эффекты, или чтобы титровать величину их реакции.

Сконструированные клетки, которые обнаруживают эти специфические для опухоли входные данные, могут быть сконструированы для получения ряда различных ответов, таких как производство агентов визуализации, которые помогают в идентификации опухолей и метастазов, и контроль эндогенных иммунных клеточных реакций, таких как хемотаксис, фагоцитоз и убийство клеток.Возможно, наиболее важно то, что эти терапевтические клетки могут быть запрограммированы на секретирование факторов, нарушающих локальное микроокружение опухоли, таких как провоспалительные цитокины и факторы антиангиогенеза, что делает их непригодными для устойчивого роста опухоли. Это было бы эквивалентно созданию специальной иммунной клетки, которая выводит из строя опухолевые клетки и микроокружение на нескольких уровнях.

Направленная иммуносупрессия

Иммунная клетка также может быть разработана для блокирования аутоиммунного заболевания или отторжения трансплантированных органов.Обычная иммуносупрессивная лекарственная терапия имеет широкие и серьезные системные эффекты. Сконструированная клетка может быть запрограммирована на местную иммуносупрессивную реакцию, возможно, в ответ на специфические аутоиммунные антигены или антигены трансплантата в сочетании с цитокиновыми сигнатурами сильного аутоиммунного ответа. Такие клетки могут быть запрограммированы на хемотаксис к участкам этих сигналов и реагировать путем секреции противовоспалительных цитокинов, которые отключили бы воспалительные петли положительной обратной связи, которые обычно приводили бы к полномасштабной аутоиммунной реакции или реакции отторжения.

Хотя индивидуально разработанные терапевтические клетки — это будущее, полезно подумать о том, какое поведение обнаружения и реакции будет ценным, так как они обеспечивают полезные целевые вехи в разработке инструментов и стратегий для перестройки клеток.

Можно ли проектировать сети передачи сигналов сотовой связи?

Существуют большие разногласия относительно того, действительно ли элементы можно спроектировать. Системы клеточной сигнализации настолько тонко оптимизированы, что наше вмешательство приведет к катастрофическим сбоям, или настолько надежно спроектированы эволюцией, что добавление новых генов и сетевых связей не сможет существенно изменить функцию? Очевидно, что эволюция смогла перестроить клеточные сигнальные пути, чтобы получить разнообразные ответы — на определенном уровне они относительно пластичны и эволюционируют.Таким образом, прежде чем пытаться создать новое клеточное поведение, может быть поучительно подумать о том, как эволюция может достичь инновационных новых функций.

Отличительной чертой сигнальных белков, которая, как полагают, играет важную роль в эволюции, является их модульная структура. Они почти всегда состоят из множества модульных доменов, некоторые из которых выполняют каталитическую функцию, а многие — специфические регуляторные функции или функции взаимодействия [19, 20]. Эти модульные домены встречаются в различных сигнальных белках в самых разных комбинациях.Это привело к модели, согласно которой разнообразие сигнальных функций может развиваться посредством рекомбинации этого набора доменов. Таким образом, в принципе, если бы мы могли понять, как эволюция работает с этими модулями, мы могли бы использовать тот же набор инструментов, чтобы найти области пространства поведения, которые эволюция, насколько нам известно, еще не исследовала.

Почему сигнальные белки и системы настолько модульны? Большинство согласны с тем, что в эволюционной временной шкале организмы находятся под давлением приспособленности к развитию инновационных клеточных сигнальных реакций, которые могут привести к преимуществам в изменяющейся окружающей среде и по сравнению с конкурирующими организмами.Под воздействием такого рода изменяющегося давления приспособленности модульные системы могут спонтанно развиваться как способ облегчить более быструю диверсификацию функций [21]. Алон и его сотрудники смоделировали эволюцию биологической сети, используя эволюционные алгоритмы для поиска простых вычислительных сетей, которые решают поставленную цель [22]. Когда они неоднократно меняют целевую цель, результирующие сети спонтанно развивают более модульные решения — сети, которые имеют внутри себя функциональные подсети. Эти заранее сформированные подсети — модули — могут быть быстро переподключены новыми способами для перехода от одной целевой функции к другой.По сути, кажется, что модули предоставляют способ быстро перемещаться из одного функционального пространства в другое, перепрыгивая через обширные области нефункционального сетевого пространства. Таким образом, модульная организация сигнальных белков и сетей может отражать давление на эти системы с целью создания поведения, которое соответствует потребностям постоянно меняющейся среды.

Важность модульности в облегчении эволюции новых функций согласуется с концепциями эволюции и развития, в которых утверждается, что большая часть диверсификации функций и морфологии организмов эволюционирует через альтернативное регулирование существующих компонентов, а не на изобретение принципиально новых компонентов [23].Хотя многие из этих идей были разработаны с упором в первую очередь на регуляцию генов с помощью различных цис-действующих модулей, они также могут применяться к регуляции ключевых каталитических сигнальных модулей с помощью разнообразных локализационных и регуляторных модулей [24,25]. Неудивительно, что многие из усилий по разработке нового сигнального поведения, описанного ниже, используют стратегии рекомбинации модульных функциональных единиц новыми способами, таким образом, по сути, используя эволюционную стратегию для создания новой функции.

Разработка новых сенсорных систем

Одним из наиболее важных инструментов для изменения поведения клеток будет способность создавать новые датчики и рецепторы для целевых входов.Однако это, пожалуй, наименее охарактеризованный элемент в инженерии клеточной сигнализации, потому что вселенная возможных входов настолько обширна и часто включает проблему работы с относительно сложными мембранно-ассоциированными мембранными белками. Ниже мы описываем недавний прогресс в модификации или конструировании различных рецепторных молекул.

Перенаправление выхода естественных рецепторов

Природные рецепторы, которые обнаруживают специфические эндогенные входы, могут быть спроектированы для генерации неродной выходной реакции.Есть несколько примеров перенаправления нативного рецептора, чтобы вызвать новый транскрипционный ответ. Один из таких подходов использует модульную структуру рецепторного белка Notch. Notch — это трансмембранный рецептор, который обнаруживает белок Delta, присутствующий на соседних клетках, — критический канал межклеточной коммуникации в развитии и дифференцировке. Когда Delta связывает Notch, трансмембранная область Notch расщепляется мембранной протеазой, высвобождая C-концевой домен Notch в цитоплазму.Этот домен может проникать в ядро ​​и активировать транскрипцию гена. Struhl et al. Показали, что этот модуль фактора транскрипции рецептора notch может быть заменен синтетическим фактором транскрипции (Gal4-AD), так что при активации in vivo этот химерный рецептор notch может активировать гены, нацеленные на новый фактор транскрипции [26 , 27]. Хотя эту конструкцию использовали в качестве репортера для активации Notch, ее можно было легко использовать для связывания обнаружения нативного дельта-лиганда с совершенно новым набором ненативных генов-мишеней.

Barnea et al. Расширили эту модульную стратегию, вдохновленную Notch, путем создания новых транскрипционных выходов для других рецепторов, которые обычно не используют этот тип механизма активации протеаз [28]. Когда рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), активируются своими специфическими лигандами, они часто рекрутируют β-аррестин, который участвует в подавлении передачи сигналов GPCR. Barnea et al. Слили аррестин с высокоспецифичной протеазой вируса травления табака (TEV), так что он был совместно задействован в активированных GPCR.Синтетический фактор транскрипции также был слит с цитоплазматическим хвостом GPCR, связанным сайтом расщепления TEV. Таким образом, когда сконструированный слитый белок GPCR активируется своим эндогенным лигандом, он рекрутирует партнера протеазы аррестин-TEV, который расщепляет и высвобождает домен фактора транскрипции из GPCR, посредством чего он может проникать в нуклеазу и активировать гены-мишени. Эта система успешно использовалась для связывания новых репортеров транскрипции с активацией широкого спектра специфических GPCR.Ответ очень специфичен благодаря специфичности расщепления TEV. В принципе, эту стратегию можно использовать для связывания любого эндогенного сигнала, опосредованного GPCR, с экспрессией желаемых генов-мишеней.

Barnea et al. Также использовали эту стратегию для связывания передачи сигналов эндогенной рецепторной тирозинкиназы (RTK) с новыми выходами транскрипции [28]. Большинство RTK при стимуляции активируют свои киназные домены, которые опосредуют аутофосфорилирование цитоплазматических тирозинов для рекрутирования белков, содержащих домен Sh3.Здесь протеаза TEV была слита с рекрутированными доменами Sh3, а синтетический фактор транскрипции был слит с цитоплазматическим хвостом RTK через сайт расщепления протеазой TEV. Итак, активация RTK ведет к рекрутированию слияния Sh3-домен-TEV, высвобождению ассоциированного с рецептором фактора транскрипции и транскрипции гена инженерии. Примечательно, что эта простая модульная стратегия может быть применена к нескольким классам рецепторов, если они привлекают определенный белок-партнер при активации.

Howard et al. Использовали модульность передачи сигналов RTK для перенаправления сигнала онкогенного роста на апоптотический ответ [29]. Они сконструировали новый адаптерный белок Sh3, в котором домен Sh3, распознающий активированный RTK, был слит с доменом эффектора смерти от Fadd. Таким образом, активация RTK привела к рекрутированию в мембрану домена смерти, что вызвало ответ клеточной смерти. Возможность увязки других новых результатов с этими ключевыми событиями найма еще недостаточно изучена.

Рецепторы, которые обнаруживают новые входные данные малых молекул

Вышеупомянутые стратегии сосредоточены на способах получения рецепторов, которые обнаруживают эндогенные сигнальные молекулы, и конструируют их так, чтобы вызывать новые ответы. Однако во многих случаях для клеточной инженерии могут потребоваться рецепторы, которые обнаруживают новые сигналы, для которых нет эндогенных рецепторов. Эти новые сигналы включают в себя небольшие молекулы, которые мы можем захотеть обеспечить внешнее управление инженерной системой.

Относительно хорошие успехи были достигнуты в использовании GPCR в качестве платформы для конструирования контролируемых рецепторов на малых молекулах.Некоторые GPCR, такие как опиоидные рецепторы, могут активироваться их эндогенными лигандами и специфическими низкомолекулярными агонистами. Конклин, Рот и его сотрудники сконструировали молекулы, известные как рецепторы, активируемые исключительно синтетическими лигандами (RASSL) [30,32]. Эти рецепторы мутированы так, что они не могут связывать свой эндогенный лиганд, но активируются и вызывают свой эндогенный нисходящий эффект в ответ на небольшой фармакологически инертный молекулярный агонист.

GPCR различаются по своим выходам, отчасти потому, что отдельные рецепторы связываются со специфическими гетеротримерными G-белками.Дальнейшая разработка дала версии RASSL, которые специфически связаны с каждым из этих отдельных нисходящих путей, тем самым позволяя малым молекулам контролировать очень разнообразный набор выходов. Эти RASSL были успешно применены у трансгенных мышей — по сути, перестраивая передачу сигналов в полноценном живом организме — в основном в качестве диагностического и аналитического инструмента. Применение было разнообразным, учитывая широкое использование GPCR в разных тканях. Например, мыши, несущие вкусовые нейроны, экспрессирующие RASSL, проявляли специфические сладкие (привлекательные) или горькие (аверсивные) ответы на воду, смешанную с агонистом (спирадолином), в зависимости от того, в каком типе нейрона они экспрессировались [33].Кроме того, экспрессия RASSL в клетках сердца позволяет контролировать частоту сердечных сокращений путем введения спирадолина [34]. То, что эти рецепторы in vivo так надежно работают, , намекает на их потенциальную полезность в более сложной клеточной инженерии.

Химические димеризаторы образуют другую стратегию достижения контроля малых молекул над передачей сигналов. Такие стратегии были рассмотрены в другом месте [35,36] и не будут здесь обсуждаться.

Рецепторы, которые обнаруживают определенные пользователем антигены

Было бы идеально разработать рецепторы, которые могут воспринимать ассоциированные с заболеванием антигены, такие как белок, сильно экспрессирующийся в опухоли или инфекционном агенте.Если бы рецепторы могли быть сконструированы для достижения такого же разнообразия и избирательности распознавания, что и антитела, можно было бы обнаруживать широкий спектр входных сигналов и связывать их с конкретными ответами. Химерные антигенные рецепторы (CAR) — рецепторы, созданные с использованием одноцепочечных антител (scFv) как часть механизма их обнаружения, — были разработаны как универсальный каркас этого типа. Эта стратегия проистекает из модульности рецепторов иммунных клеток, таких как рецептор Т-клеток. Хотя Т-клеточный рецептор представляет собой сложный мультибелковый комплекс, сшивания цитоплазматической области субъединицы дзета-цепи CD3 достаточно для индукции передачи сигналов Т-клетками [37].Дзета-цепь CD3 содержит мотивы, которые фосфорилируются при активации тирозинкиназами, такими как Lck, для индукции рекрутирования белков, содержащих домен Sh3, таких как киназа ZAP-70. Слияние цитоплазматической области дзета-цепи CD3 с внеклеточным одноцепочечным антителом (scFv) дает рецептор, часто называемый «Т-тельцем», который при экспрессии в Т-клетках приводит к целенаправленному уничтожению клеток, экспрессирующих узнаваемый антиген (предположительно, поверхностные антигены сшивают и активируют химерные рецепторы) [38,39].Слияние scFv с внутриклеточной областью рецептора Fc (гамма-цепь) может дать химерный антиген-чувствительный рецептор аналогичного типа. Эти исследования подчеркивают модульность этих рецепторов: соединение нового внеклеточного распознающего элемента с нижележащими внутриклеточными сигнальными элементами приводит к новому датчику ввода / вывода.

Эти CAR первого поколения относительно примитивны и дали неоднозначные результаты. Т-клетки, экспрессирующие CAR, направленные против опухолевых антигенов, обладают умеренной сигнальной способностью по сравнению с эндогенными ответами TCR, умеренно пролиферируют ex vivo и in vivo и имеют низкую выживаемость при многократном воздействии антигена [16,17]].Улучшения в этом поведении были сделаны путем включения дополнительных модульных доменов во внутриклеточные области CARs, включая домены от молекул корецепторов, которые являются частью нормальной активации TCR, таким образом, возможно, имитируя более полную активированную внутриклеточную сборку [40,41]. Клетки, содержащие CAR следующего поколения, более эффективно контролируют опухоли ксенотрансплантата у мышей, и в настоящее время переносятся на клинические испытания [16]. Более сложная инженерия CAR может привести к еще большему улучшению терапевтической функции.

Датчики, которые обнаруживают физические сигналы, такие как свет

Еще одна интересная область исследований — разработка генетически закодированных датчиков, которые могут обнаруживать свет и преобразовывать его в конкретный биологический ответ, область, называемая оптогенетикой. Встречающиеся в природе светочувствительные белки растений, водорослей и бактерий можно модифицировать для использования в высших организмах, включая млекопитающих. Эти инструменты чрезвычайно полезны в качестве пространственно-временных шкал для контроля и анализа сложного клеточного и организменного поведения, особенно когда они экспрессируются с помощью промоторов, специфичных для клеточного типа.В долгосрочной перспективе оптогенетические инструменты могут использоваться для удаленного контроля клеток, используемых в терапевтических целях, хотя существуют серьезные технические проблемы, такие как то, как свет может доставляться в организм, которые необходимо будет преодолеть. Наиболее часто используемые сегодня оптогенетические инструменты — это белки микробного канала родопсин и галородопсин, которые широко используются для контроля функции нейронов. Они рассмотрены в другом месте [42] и не будут здесь подробно обсуждаться.

Совсем недавно появились дополнительные оптогенетические инструменты, которые могут быть применены к более широкому спектру клеточных сигнальных систем.Airan et al. Сконструировали набор активируемых светом GPCRs, которые могут связываться как с нижележащими Gs, так и с гетеротримерными G-белками Gq [43]. Были созданы химеры светочувствительной зрительной системы GPCR, родопсин (бычий), которые содержат внутриклеточные петли от Gq- и Gs-сопряженных адренергических рецепторов. Эндогенная молекула сетчатки — это светочувствительный хромофор. Эти новые инструменты значительно расширяют «словарь» передачи сигналов, которым можно управлять с помощью света, учитывая важность путей передачи сигналов Gq и Gs в различных типах клеток.

Еще более обобщенная стратегия управления светом включает использование контролируемых светом белковых взаимодействий. Временное взаимодействие конкретных белков-партнеров является основой многих внутриклеточных сигнальных событий (см. Ниже), и рецепторы могут быть обойдены, так что свет напрямую контролирует такие внутриклеточные взаимодействия. Левская и др. Использовали систему взаимодействия фитохрома, полученную из растений — связывание этого фоторецептора с его партнерским доменом PIF может включаться и выключаться с помощью определенных длин волн света — для рекрутирования определенных белков на мембрану точным пространственно-временным образом [44].В случае факторов обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), которые контролируют GTPases семейства Rho, это может быть использовано для запуска активации GTPase и последующих изменений цитоскелета, приводящих к световодному выпячиванию клеток. Хотя этот метод является мощным и потенциально применимым ко многим сигнальным взаимодействиям, система Phy-PIF требует добавления проницаемого для клетки хромофора, который не является эндогенным для клеток млекопитающих. Wu et al. Использовали светочувствительный домен LOV (свет-кислород-напряжение) (обнаруженный в растениях, водорослях и бактериях) для конформационной закупорки Rac GTPase контролируемым светом способом [45].Этот связывающий флавин домен обеспечивает еще один потенциально общий конформационный элемент управления светом, который может быть связан для управления различными сигнальными белками.

Инженерные системы обработки сигналов

В конечном итоге клетки решают, какие программы ответа выполнять на основе внутриклеточных сигнальных сетей, которые принимают и обрабатывают сигналы от сенсорных молекул (см. Выше). Недавняя работа в области сотовой инженерии была сосредоточена на понимании того, как эти сети функционируют для принятия решений и как их можно изменить.

Модульная логика обработки сигналов

Внутриклеточные сигнальные белки имеют высокую модульность (см. Выше). Большинство модулей делятся на два класса (). Первый класс — это ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, которые катализируют посттрансляционные модификации или конформационные изменения, с помощью которых сохраняется информация. В большинстве случаев эти каталитические домены входят в пары: ферменты-писатели (например, киназы) производят модификацию, а ферменты-стиратели (например, фосфатазы) удаляют модификацию.Второй класс — это регуляторные домены или домены взаимодействия, которые модулируют активность каталитических доменов или нацеливают их на конкретных партнеров или сайты в клетке. Эти модули могут опосредовать специфические белок-белковые взаимодействия (либо конститутивные взаимодействия, либо те, которые зависят от посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование) или белок-мембранные взаимодействия. Таким образом, именно регуляторные домены и домены взаимодействия определяют, когда и где активируются каталитические домены и каким партнерам они передают информацию [5].

a | ферментных и регуляторных доменов . Модульные сигнальные белки эукариот обычно состоят из ферментативных доменов и доменов локализации. Ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, а также GEF и GAP, катализируют регуляторные модификации, такие как фосфорилирование и активация GTPase, соответственно (ферментные домены часто входят в пары «писатель» и «стиратель», которые имеют противоположные активности).Эти ферментные домены регулируются и нацелены на домены взаимодействия, включая домены межбелкового взаимодействия, домены мембранного взаимодействия или трансмембранные домены.

b | различных классов многодоменных архитектур . Ферментативные домены могут быть непосредственно нацелены на определенные субстраты, партнеров или субклеточные участки посредством доменов взаимодействия. В качестве альтернативы они могут быть косвенно нацелены через адаптеры или белки каркаса, которые содержат несколько доменов взаимодействия.Домены взаимодействия могут также аллостерически регулировать каталитические домены, участвуя во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях. Такие переключающие белки могут быть активированы конкурирующими лигандами, которые снимают аутоингибирование.

Эти разные классы модулей обнаруживаются в различных комбинациях и расположениях в сигнальных белках (). Каталитические домены, слитые с нацеливающими доменами, могут быть задействованы в определенных комплексах или участках мембраны, где они будут модифицировать определенные мишени; часто эти каталитические домены имеют высокую внутреннюю константу Михаэлиса (Km’s и, следовательно, требуют нацеливания с помощью дополнительных доменов взаимодействия для эффективного катализа.Иногда эти нацеленные взаимодействия регулируются, если, например, взаимодействие зависит от посттрансляционной модификации, такой как нацеливание белков домена Sh3 на аутофосфорилированные сайты pTyr на активированных RTK. Белки с двумя доменами взаимодействия могут действовать как адаптеры, которые переводят одно взаимодействие во второе, что приводит к увеличению гибкости ответа в зависимости от адаптерных белков, которые экспрессируются в конкретном типе клеток. Белки с множественными доменами взаимодействия могут также функционировать как скаффолдные белки, которые организуют несколько белков на пути в комплекс.Эти взаимодействия могут быть конститутивными или предопределенными, или индуцированными такими факторами, как фосфорилирование или конформационные изменения, которые открывают сайты взаимодействия. Таким образом, каркасные белки могут в принципе определять проводные связи сигнальных белков, а также контролировать, когда и где происходит передача сигналов [24, 20].

Вторая важная роль взаимодействия и регуляторных доменов — это непосредственный контроль активности каталитических доменов. Во многих случаях домены взаимодействия участвуют во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях, которые стерически закрывают каталитический домен или конформационно возмущают его — тип регуляции, называемый модульной аллостерией [46].Связывание конкурирующих межмолекулярных лигандов с доменами взаимодействия индуцирует каталитическую активность белков. Часто множественные домены взаимодействия участвуют в автоингибировании каталитического домена кооперативным или иерархическим образом [47, 48]. Эти белки могут функционировать как сложные переключатели с множеством входов, которые требуют определенной комбинации входов для правильной активации. Кроме того, поскольку внешние лиганды активируют эти белки, локализация (управляемая этими взаимодействиями) может быть напрямую связана с активацией.

Разработка новых белковых переключателей

Лим и его сотрудники исследовали, можно ли использовать модульную аллостерическую логику многих природных эукариотических сигнальных белков для создания новых сигнальных переключателей путем рекомбинации доменов (). В самом деле, каталитические домены актинового регуляторного белка N-WASP и GEF семейства Rho могут быть связаны с новыми аутоингибиторными доменами с образованием белков, активность которых регулируется новыми лигандами [49,50]. Внутримолекулярное связывание любого из этих каталитических доменов с доменом PDZ и пептидом лиганда PDZ может давать переключатель, который активируется конкурирующим пептидом PDZ.Точно так же можно добавить несколько доменов взаимодействия, чтобы получить комбинаторный переключатель, отображающий управление логическим элементом И. В зависимости от точной конфигурации доменов и внутримолекулярных взаимодействий типы регуляции могут быть разными в ответ на разные конкурирующие внешние лиганды — один лиганд может активировать белок, а другой репрессировать его. Эти типы разнообразных взаимоотношений между регуляторными доменами напоминают разнообразное поведение, наблюдаемое в природных сигнальных белках, подтверждая представление о том, что этот вид архитектуры переключения облегчает эволюцию разнообразных комбинаторных регуляторных переключателей [48].Dueber et al. Также показали, что синтетические аутоингибирующие переключатели, использующие поливалентные взаимодействия одного и того же типа, приводят к переключениям, поведение активации которых может быть настроено кооперативно от линейного до цифрового ответа [51].

a | инженерных переключателей аллостерических белков . Dueber et al [49,51] показали, что аллостерическая регуляция сигнального белка N-WASP может быть перепрограммирована путем рекомбинации каталитического домена из N-WASP с различными комбинациями доменов взаимодействия.Новые модели поведения включали управление с множеством входов (логический элемент И) и активную активацию, подобную переключателю.

b | с использованием белков каркаса в качестве молекулярной печатной платы для преобразования выходных сигналов . Связь входа / выхода киназного пути MAP в дрожжах может быть перенаправлена ​​через сконструированный химерный каркас, который собирает новую комбинацию киназ [58]. Новые сайты взаимодействия также могут быть добавлены к каркасам для привлечения дополнительных модулирующих факторов.Эти дополнительные факторы могут быть построены синтетическими петлями обратной связи, которые могут быть использованы для создания путей, которые отображают разнообразную динамику передачи сигналов [62].

Каркасные белки как молекулярные схемы

Цепи внутриклеточной передачи сигналов также можно напрямую контролировать, используя регуляторные взаимодействия для перепрограммирования соединений путей. Например, каталитический домен киназы семейства Src, Hck, который обычно регулируется доменами Sh3 и Sh4, может быть слит с доменом PDZ и направлен in vivo для специфического фосфорилирования субстратов с мотивом лиганда PDZ [52].

Белки каркаса также могут быть использованы для создания новых взаимосвязей между входом и выходом пути. У дрожжей существует множество функционально различных киназных путей митоген-активированного протеина (MAP), которые регулируют ответы на феромон спаривания и осмотический стресс [53,54]. Эти пути имеют общие компоненты киназ, но остаются специфическими, потому что каждый путь организован отдельным каркасным белком [55–57]. Химерный каркасный белок, который организует избранных членов путей спаривания и осмотического стресса, дает неприродный путь, в котором феромон спаривания специфически индуцирует программу реакции осмостресса в vivo [58].Подобные ковалентные слияния, которые, подобно каркасу, вызывают взаимодействие между двумя сигнальными белками, могут быть использованы для принудительной передачи сигнала по единственному пути [59].

Совсем недавно было показано, что каркасные белки не только опосредуют линейные отношения ввода / вывода путей, но также координируют набор модуляторных факторов, которые формируют дозовую зависимость и динамику ответа пути [60,61]. Вдохновленный этими природными примерами, Башор и др. Показали, что дрожжевой скаффолд MAP-киназы, белок Ste5, можно использовать в качестве молекулярной печатной платы, чтобы гибко изменять количественное поведение реакции спаривания [62].Слияние дополнительного сайта синтетического взаимодействия с каркасом Ste5 (с использованием пары гетеродимеров лейциновой застежки) способствует привлечению новых модулирующих факторов, таких как фосфатаза MAPK, которая подавляет ответ пути. Однако, если экспрессия и рекрутирование фосфатазы связаны с выходным сигналом пути, возникает петля отрицательной обратной связи, которая приводит к адаптации — временный ответ, за которым следует автоматический возврат к более низким уровням выхода, что является ключевым поведением во многих биологических сенсорных системах.Связывая по-разному положительные и отрицательные модуляторы пути, этот небольшой набор элементов управления каркасом может быть использован для генерации очень разнообразных дозовых реакций и динамического поведения, включая высоко кооперативное переключение, отложенные ответы, ускоренные ответы и генерацию импульсов. Эти исследования показывают, как организующие центры, такие как каркас, являются богатой платформой для обработки и формирования внутриклеточной передачи сигналов посредством эволюции или инженерии.

Инженерная пространственная самоорганизация

Один из наиболее плохо изученных аспектов передачи сигналов в клетке — это то, как контуры, состоящие из диффундирующих молекул, могут приводить к высокоточной пространственной организации в клетке, такой как направленная поляризация и миграция.Этот тип самоорганизации является аспектом схемы управления, где нет хороших электронных или инженерных аналогов, и где биология может обучать инженерии.

Инженерные принципы применяются для понимания механизма поляризации почкующихся дрожжей, S. cerevisae . Поляризация контролируется GTPase Cdc42, которая в конечном итоге локализуется в одном сайте материнской клетки, приводя к образованию единственной почки, которая врастает в дочернюю клетку [63].Примечательно, что этот процесс приводит к образованию единственной бутоны почти со 100% надежностью. Цепь положительной обратной связи с участием Cdc42 GTPase является ключевой в поляризации: активный Cdc42 на мембране рекрутирует цитоплазматический белок GEF Bem1, который активирует и локализует дополнительный Cdc42 [64]. Хотя этот вид петли обратной связи ведет к образованию фокусов Cdc42, быстрая диффузия и перераспределение Bem1 между конкурирующими фокусами может быть важным, чтобы позволить одному из фокусов стать доминирующим, что ведет к сингулярности почкования.Эффект замедления диффузии и перераспределения Bem1 за счет связывания его с трансмембранным мотивом был проанализирован [65]. Bem1, привязанный к мембране, может спасти летальность от нокаута Bem1, но не может подвергаться диффузии в цитоплазме. Вместо этого он доставлялся к плазматической мембране в везикулах через актиновые кабели (также координируемые фокусами Cdc42) и от мембранных фокусов посредством эндоцитоза и, таким образом, перераспределялся намного медленнее. Наблюдались серьезные дефекты сингулярности, такие как множество устойчивых конкурирующих фокусов Cdc42, и частота многопочкованных клеток увеличивалась до ~ 5%.Подобные исследования помогают выявить требования к точно контролируемой пространственной самоорганизации и предполагают, что мы можем научиться создавать сигнальные цепи, которые производят индивидуальные пространственные результаты с важным терапевтическим поведением (например, регенеративная медицина, которая требует определенной клеточной морфологии и ориентации).

Создание предсказуемой инженерии передачи сигналов

Исследования, приведенные выше, показывают, что сигнальные системы являются высокомодульными и пластичными и рекомбинирующие модули, особенно каталитические домены с новыми регуляторными доменами, могут приводить к отличному ответному поведению.Таким образом, вопрос уже не в том, можно ли спроектировать сигнальные системы для получения нового поведения, а в том, можно ли их спроектировать таким образом, чтобы мы могли предсказать, какое поведение проявится и насколько успешной будет каждая спроектированная схема.

Проблема непредвиденных перекрестных помех

Одна из основных проблем, связанных с передачей сигналов инженерной клетки, заключается в том, что естественные компоненты — инструментарий доступных доменов — повторно используются, что может привести к непредвиденным перекрестным помехам. Приведут ли инженерные взаимодействия, которые вы создаете, к специфическому фосфорилированию желаемого белка, или используемый домен также будет перекрестно взаимодействовать с другими мишенями, конкурентно титруя важные физиологические взаимодействия и приводя к непредвиденным эффектам или сбоям в спроектированной схеме? Часто природные части не обладают абсолютной специфичностью, и эволюция, скорее всего, использует сложные сети перекрестной реактивности, чтобы обеспечить важную скоординированную регуляцию.Хотя такая сложная система, похожая на нейронную сеть, может обеспечить преимущества для клетки, это проклятие для прогнозной инженерии.

Представляя будущий инструментарий сигнализации

Одним из решений этой проблемы является сборка инструментария из деталей, специально оптимизированных для проектирования. Этот вопрос важен для любого типа сигнальной части, но мы сосредоточимся на том, как собрать полезный инструментарий из частей, взаимодействующих с белками ().

Нативная клетка имеет свой собственный репетитор модулей взаимодействия с белками, и поэтому сложно разработать новые функции с использованием связанных модулей взаимодействия, которые могут показывать непреднамеренные и непреднамеренные перекрестные помехи в камере.Оптимизированный набор взаимодействующих частей может значительно повысить предсказуемость клеточной инженерии, исключив возможность непреднамеренных перекрестных помех. Несколько стратегий оптимизации включают разработку модулей взаимодействия, которые используют неиспользованную специфичность; разработка составных, многодоменных взаимодействий; объединение модулей взаимодействия с новым субклеточным нацеливанием; и импорт модулей ортогонального взаимодействия (либо созданных синтетически, либо из других организмов), которых нет в клетке-хозяине.

Хотя природа неоднократно использовала семейства частей, такие как домены взаимодействия определенного типа, недавние исследования показывают, что в некоторых случаях члены семейства содержат неиспользуемые сайты узнавания внутри этих доменов. Их можно использовать для создания пар домен-пептид, которые одновременно оптимизированы для взаимодействия со своим правильным партнером, избегая при этом перекрестного взаимодействия с другими членами семейства [66,67]. Фактически были сконструированы пары PDZ-домен-лиганд и гетеродимеризующиеся пары лейциновой застежки-молнии, которые оптимизированы, чтобы избежать перекрестной реакции с естественными доменами того же типа [68,69].Избирательность и предсказуемость существующих доменов взаимодействия также можно улучшить путем разработки составных взаимодействий. Конечно, многодоменное сотрудничество — естественный механизм повышения специфичности. Но новый поворот в этом вопросе — это разработка составных двухкомпонентных взаимодействий типа «раскладушка». Koide et al. Взяли домен PDZ и слили его с доменом фибронектина [70]. Используя фаговый дисплей, они отобрали варианты этого тандемного домена, которые связывают определенный пептид, так что он находится между двумя доменами.Резко увеличенная площадь распознавания приводит к взаимодействиям с гораздо более высокой специфичностью и сродством. Другое решение для специфичности, которое наблюдается в природе, — это дифференциальная компартментализация. Если нацеливающие мотивы могут быть использованы для локализации партнерских белков в определенных органеллах или клеточных участках, то мотивы взаимодействия, вероятно, будут функционировать более специфическим образом, особенно если в этом месте или органелле происходит мало или совсем не происходит конкурирующих взаимодействий этого типа.

Альтернативный подход к достижению надежной специфичности заключается в импорте доменов из других организмов, которых нет в создаваемом хозяине. Напр., PDZ домены могут быть импортированы в дрожжи (у которых отсутствует большинство таких доменов), хотя возможность случайных перекрестных реагирующих партнеров не может быть исключена [58]. Примером ортогональной молекулярной системы, которая была успешно перенесена на нового хозяина, является бактериальная рекомбиназная система Cre-Lox, которая надежно используется для создания сложных хромосомных перестроек в сложных организмах, включая мышей [71].

Таким образом, представляя инструментарий будущего, можно захотеть создать набор из десяти или около того пар взаимодействия белков, оптимизированных для конкретного выбранного организма (например, E.coli , S.cerevisae , млекопитающие) в том, что они ортогональны, то есть известно, что они не реагируют перекрестно с протеомом хозяина или белками в наборе инструментов, за исключением их родственного лиганда. Также важно, чтобы эти взаимодействия были настраиваемыми, поэтому серия лигандов для каждого домена взаимодействия, которые различаются по аффинности на несколько порядков, были бы идеальными.Это позволило бы систематически исследовать, как сродство вербовки меняет поведение системы.

Комбинаторный дизайн и прогнозирование

Другой другой, но все же дополнительный подход к предсказуемому проектированию передачи сигналов соты состоит в использовании комбинаторной изменчивости. В ходе естественной эволюции рекомбинация сигнальных модулей для генерации новой функции, по-видимому, не была спроектирована или направлена, а скорее была относительно случайной, и именно естественный отбор выявил события перепрограммирования, которые привели к преимуществам приспособленности.Таким образом, очень плодотворным подходом, учитывая отсутствие предсказуемости в клеточной инженерии, могло бы быть построение комбинаторных библиотек синтетических схем и выбор желаемой функции [25,72]. Более того, этот подход можно было бы комбинировать с полу- прогнозное проектирование, при котором могут быть разработаны общие архитектуры спроектированных схем, но комбинаторные методы используются для поиска в более широком диапазоне пространства параметров (с использованием вариантов каждого модуля в библиотеке). Сосредоточение внимания на комбинаторном выборе может также обеспечить очень полезную стратегию на заре синтетической биологии, поскольку это может помочь нам быстрее узнать о основных принципах проектирования.

Outlook

Цель понимания того, как клетки общаются и принимают решения, остается очень привлекательной, особенно потому, что понимание молекулярного языка внутри клетки может позволить нам общаться с клетками и инструктировать их выполнять новые запрограммированные функции. Наша способность перестраивать клеточную сигнализацию может обеспечить множество мощных приложений, таких как терапевтические клетки, запрограммированные на обнаружение селективного набора сигналов, связанных с заболеванием, и на локальный ответ точно настроенным образом.

Хотя эволюция достигла такого рода инноваций и точной инженерии клеточных функций, мы только начинаем понимать, как достичь такого рода цели. У нас есть хорошее фундаментальное понимание логики клеточных сигнальных механизмов и источников функциональной пластичности. Кроме того, были сделаны первые важные шаги в разработке новых рецепторно-сенсорных систем, а также новых или модифицированных схем обработки внутриклеточных сигналов. Несмотря на эти инструменты, на сегодняшний день было приложено очень мало усилий для того, чтобы связать эти типы компонентов новыми способами, чтобы получить более крупные интегральные схемы, способные давать очень точные и точные отклики.Такие усилия продолжаются. Например, Cell Propulsion Lab — это наномедицинский центр Национального института здравоохранения (http://nihroadmap.nih.gov/nanomedicine/devcenters/cellularcontrol.asp), который пытается использовать относительно простые противоопухолевые иммунные клетки, созданные с использованием синтетических рецепторов химерных антигенов ( CAR), и улучшают обработку их сигналов и набор ответов, которые они вызывают, чтобы оптимизировать клетки для экспансии ex vivo, , in vivo, выживания, противоопухолевой цитотоксичности и нарушения благоприятного микроокружения опухоли.Будет интересно увидеть, как будут развиваться эти типы усилий и как эти проблемы повысят сложность и надежность сотовой инженерии.

a | перенаправление собственных входов на новые выходы . С-концевой домен рецептора notch представляет собой фактор транскрипции, который высвобождается в результате трансмембранного протеолиза при активации лигандом дельта. Замена альтернативным доменом фактора транскрипции дает новый ответ экспрессии гена [26].Выход рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), может быть перенаправлен аналогичным образом путем слияния домена фактора транскрипции через привязку с сайтом протеазы TEV. Активация GPCR приводит к привлечению белка аррестина. Если в клетке экспрессируется слияние протеазы аррестин-TEV, активация GPCR приводит к высвобождению фактора транскрипции и новому выходу экспрессии гена [28]. Таким образом, активация GPCR может быть произвольно связана с новым транскрипционным выходом. Выход рецепторной тирозинкиназы (RTK) может быть перенаправлен за счет привлечения синтетических адаптеров домена Sh3 или PTB к активированному и фосфорилированному тирозин рецептору.Домен Sh3 может быть использован для рекрутирования протеазы TEV (чтобы снова высвободить искусственно связанный транскрипционный домен) [28] или для рекрутирования новых эффекторных доменов, таких как те, которые участвуют в гибели клеток [29].

b | инженерный новаторский контроль ввода для собственных ответов . GPCR были сконструированы так, чтобы их контролировали низкомолекулярные агонисты путем мутации их внеклеточной поверхности, так что они больше не связывают свои эндогенные лиганды (рецепторы, активируемые исключительно синтетическим лигандом — RASSL [32]).Рецепторы, которые активируют Т-клетки в ответ на произвольные входные данные, могут быть созданы путем слияния сконструированных одноцепочечных антител (scFv) с внутриклеточной областью Т-клеточного рецептора (дзета-цепь CD3), которые называются рецепторами химерных антигенов (CARs [16, 17]). Событие передачи сигнала, опосредованное рекрутингом, может быть помещено под световой контроль путем замены эндогенного взаимодействия на светозащитное взаимодействие, пара взаимодействий Phytochrome-PIF от растений [44].

a | Цепь поляризации дикого типа контролирует образование одиночных почек. В почкующихся дрожжах локализованная активация полярности GTPase Cdc42 усиливается петлей положительной обратной связи — активный Cdc42 рекрутирует каркасный белок Bem1, совместно собирает активированную p21 киназу (PAK — Ste20) и Cdc42 GEF (Cdc24). Хотя клетка может иметь несколько фокусов Cdc42, они быстро распадаются на один доминантный фокус, который развивается только в клетки. Предполагается, что быстрая скорость обмена диффундирующим комплексом Bem1 / PAK / GEF между конкурирующими фокусами Cdc42 является критической для разделения в один доминантный фокус.

b | синтетическая цепь медленной поляризации приводит к образованию множественных бутонов . Чтобы проверить эту гипотезу, Bem1 был искусственно привязан к мембране через слитый мотив нацеливания на мембрану [65]. Хотя этот связанный с мембраной Bem1 может должным образом собирать комплекс Bem1 / PAK / GEF на участках активности Cdc42 (т.е. петле положительной обратной связи), обмен комплексом между конкурирующими фокусами Cdc42 происходит медленно (зависит от везикулярного транспорта через актиновые кабели и эндоцитоза) .Эта синтетическая поляризационная схема, следовательно, приводит к плохому разрешению конкурирующих фокусов Cdc42 и гораздо более высокой частоте (5% против ~ 0%) многопучковых клеток (микрофотографии из [65]).

Ссылки

Разработка индивидуальных сигнальных цепей клеток

Nat Rev Mol Cell Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 8 ноября.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC2975372

NIHMSID: NIHMS246517

Wendell A.Lim

HHMI и отдел клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF, The Cell Propulsion Lab, NIH Nanomedicine Development Center, NSF Synthetic Biology Engineering Research Center

Венделл А. Лим, HHMI и отдел клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF , Лаборатория движения клеток, Центр разработки наномедицины NIH, Исследовательский центр синтетической биологии NSF;

Abstract

Живые клетки развили широкий спектр сложных сигнальных реакций, которые позволяют им выживать в различных условиях окружающей среды и выполнять определенные физиологические функции.Наше все более сложное понимание молекулярных механизмов клеточных сигнальных сетей у эукариот выявило удивительно модульную организацию, и синтетические биологи изучают, как это можно использовать для создания клеток с новым сигнальным поведением. Этот подход начинает раскрывать логику того, как клетки могут развивать инновационные новые функции, и подталкивает нас к захватывающей возможности создания пользовательских клеток с точными функциями восприятия и реакции, которые могут быть полезны в медицине и биотехнологии.

Ключевые слова: передача сигналов клеток, инженерия, синтетическая биология, терапевтический, MAP-киназа, каркас, модули, белковые взаимодействия, N-WASP, рецепторы, GPCR, Notch, RTK, рак, адоптивная иммунотерапия, химерные антигенные рецепторы, Т-клетки. , оптический контроль, биопродукция

Живые клетки — это высокодинамичные системы, которые используют сложные молекулярные сигнальные цепи для мониторинга внешнего и внутреннего состояния и выполнения соответствующих физиологических реакций. Как и любая сенсорная машина, созданная или созданная человеком, эти клеточные сигнальные цепи содержат подсистемы принятия решений, которые действуют как сенсоры и процессоры (например, рецепторы и их последующие эффекторы), которые в конечном итоге контролируют различные подсистемы ответа (такие как транскрипция генов и динамика цитоскелета) ( ).Основная цель современной клеточной биологии — понять, как эти молекулярные сигнальные системы достигают своих сложных ответов, которые оптимально настроены для их физиологической роли. Хотя подавляющее большинство исследований нацелено на анализ, картирование и анализ сигнальных сетей клеток, наше растущее понимание того, как работают эти системы, привело к появлению радикально нового подхода — усилий по разработке и созданию собственных синтетических сигнальных цепей [1,2 ].

a | Клетки обычно воспринимают стимулы окружающей среды через рецепторы и другие датчики .Затем эта информация обрабатывается внутриклеточными сигнальными сетями, которые, в свою очередь, задействуют различные клеточные продукты, включая экспрессию генов, секрецию, изменения цитоскелета и рост клеток.

b | Некоторые из основных проблем в развитии или разработке новых сигнальных цепей: : достижение правильной связи определенных входов и конкретных выходов; настройка количественного поведения сигнального ответа — доза-реакция и динамика — так, чтобы они были оптимальными для физиологической функции; и создание устойчивых пространственно самоорганизующихся процессов, таких как процессы, связанные с поляризацией клеток, направленной подвижностью, делением клеток и компартментализацией клеток.

Здесь мы сосредоточимся на синтетической биологии передачи сигналов и посмотрим, как можно спроектировать сигнальные схемы эукариотических клеток для создания клеток с заданным поведением передачи сигналов. Эукариотические клетки используют сети сигнальных белков, чтобы ощущать окружающую их среду и обеспечивать быстрые ответы. Поскольку сети обработки сигналов в клетках функционируют в трехмерном пространстве, они также контролируют сложные пространственные или морфологические клеточные реакции. Мы рассмотрим, как могут быть созданы сигнальные цепи с точным поведением реакции, учитывая, как определяется специфичность ответа (то есть, какие наборы выходных сигналов связаны с конкретным входом), как точно настроенная доза-реакция или временная динамика профили ответов оптимизированы для конкретных физиологических функций и того, как можно достичь сложного пространственного и морфологического контроля ().Мы также рассмотрим, почему появились усилия по разработке и созданию специализированных синтетических сигнальных цепей, как они могут обеспечить более глубокое видение принципов и механизмов разработки молекулярных сигнальных систем и как индивидуализированные реакции на поведение могут быть применены в медицине и биотехнологии. Наконец, мы рассматриваем, как в будущем могут быть разработаны инструменты и методы, которые упростят разработку клеточного поведения.

Почему инженерная сигнализация ячейки?

Прежде чем рассматривать конкретные примеры сконструированных сигнальных путей, полезно обсудить мотивацию инженерии клеточной сигнализации.Попытка создать новое сигнальное поведение в клетках может показаться смелой и глупой целью, учитывая, что у нас еще нет полного или надежного предсказательного понимания естественных сигнальных цепей клеток. Однако разработка клеточной сигнализации — это не просто процесс применения уже хорошо разработанного понимания, но она предлагает подход к «пониманию через построение». В то время как биология традиционно была наукой анализа и деконструкции для выявления генов и молекул, которые важны для конкретного процесса, синтетическая биология предлагает обратный подход, фокусируясь на том, как отдельные молекулярные части могут быть собраны в системы, которые выполняют сложное поведение.Поскольку в настоящее время у нас есть полностью секвенированные геномы и огромное количество протеомных данных, нам не хватает не полного списка молекулярных частей, а скорее понимания того, как эти части сочетаются друг с другом функционально согласованным образом. Разработка новых сигнальных сетей клеток предлагает нам подход к тестированию и расширению нашего понимания принципов организации сложных молекулярных систем.

В этом смысле синтетическая биология передачи сигналов не просто ориентирована на достижение цели приложения, такой как построение клетки с целевой функцией, но также является исследовательской наукой, в которой важно понимать, какие конструкции «работают». и как они соотносятся с «неработающими» дизайнами.Если, например, у кого-то есть естественная сигнальная сеть, которая выполняет сложное представляющее интерес поведение, традиционная генетическая деконструкция может использоваться для идентификации молекул и связей, которые необходимы и важны для функции (). Однако затем можно использовать синтетические подходы для систематического изучения многих типов изменений — альтернативных сетевых связей, настройки силы связей, добавления новых связей — для проверки того, какие сети совместимы с этим интересующим поведением. Анализируя естественную сеть или проектируя единственную успешную схему, вряд ли можно получить более глубокое понимание функционального ландшафта, которое может дать более полное и систематическое исследование синтетической схемы () [3–5].В этом смысле попытки спроектировать клеточное поведение сродни ранней истории синтетической органической химии, где синтез новых или модифицированных молекул обеспечил дополнительный подход к химическому анализу в развитии фундаментальных теорий химической связи, структуры и реакционной способности [ 6]

и | понимание принципов дизайна. Традиционно для анализа сигнальной сети используются такие методы, как нарушение гена.Синтетические подходы предлагают дополнительную информацию, создавая альтернативные версии сети, которые различаются как подключением к сети, так и мощностью каналов. Сопоставляя пространство функциональных (красные кружки) и нефункциональных (синие кружки) вариантов, можно получить более глубокое понимание функциональных требований.

b | конструирует дизайнерские сигнальные пути для терапевтических или биотехнологических приложений. Мы надеемся собрать набор сигнальных модулей, которые можно использовать для создания ячеек со спроектированными сигнальными ответами.Противораковая клетка может обнаруживать комбинацию сигналов опухоли и давать такие ответы, как выработка реагентов для визуализации, уничтожение клеток или секреция факторов, нарушающих микросреду опухоли. Такая ячейка может также иметь предохранительные выключатели, которые могли бы отключить ячейку при необходимости. Иммуносупрессивная клетка может обнаруживать комбинацию аутоиммунного ответа или сигналов отторжения трансплантата и запускать локальные контрмеры, такие как секреция противовоспалительных цитокинов. Интеллектуальная биопродуктивная (ферментационная) клетка будет спроектирована так, чтобы точно модулировать поток роста по сравнению с производственными путями в ответ на стрессовое состояние клетки, тем самым оптимизируя общий урожай.

Изучение пластичности сигнальных путей и того, как их функции могут быть настроены, также имеет отношение к патологии и лечению заболеваний. Многие виды рака обладают онкогенными мутациями, которые эффективно «переплетают» сигнальные сети клеток, контролирующие баланс между ростом, дифференцировкой и гибелью клеток [7]. Точно так же многие внутриклеточные патогены, включая бактерии и вирусы, производят специфические белки, которые «переплетают» эндогенные сигнальные пути [7]. 8–10]. Многие белки бактериальных патогенов, которые взаимодействуют с клеточной сигнальной киназой и путями регуляции актина, часто для подавления иммунного ответа хозяина или усиления инфекции (см. Дополнительную вставку 1).Таким образом, используя синтетическую биологию для понимания пластичности путей и того, как их поведение изменяется из-за сетевых возмущений, мы можем получить лучшую основу для понимания стратегий, которые патоген принимает для использования внутренней уязвимости сигнальных сетей. Более того, мы можем разработать стратегии для возврата больной сети к стабильному, непатологическому поведению. Наиболее стабильные методы лечения на основе сети могут включать не просто блокировку первичного онкогенного белка лекарством, а изменение структуры сети таким образом, чтобы она располагалась в новой и стабильной области поведенческого пространства.

Применение инженерной передачи сигналов в терапии и биотехнологии

Еще одним мотивом для разработки сигнального поведения клеток является возможность конструирования клеток, запрограммированных для выполнения точно разработанных приложений (). Представьте себе, если бы мы могли имитировать и превзойти эволюцию, используя набор молекулярных компонентов для генетической инженерии клеток, которые выполняют индивидуально разработанные реакции. По мере развития биологии стволовых клеток [11–12] и развития таких методов, как адоптивная иммунотерапия [13–14], возможность использования клеточной терапии становится все ближе, но это потребует сложной клеточной инженерии для точного контроля поведения клеток.Например, без нового контроля, как может быть направлена ​​правильная миграция и дифференцировка стволовых клеток для регенеративной медицины при отсутствии нормальных сигналов развития? Более того, по мере того, как все больше промышленных производственных процессов задействуют биологические организмы (такие как производство биотоплива или материалов) [15], может появиться возможность разработать более разумные производственные штаммы, которые, как и макроскопические производственные объекты, будут иметь системы клеточного контроля, которые отслеживают внешние и внутренние состояния для оптимизации производство.Это может быть особенно важно, поскольку мы просим ферментирующие организмы, такие как дрожжи, производить широкий спектр материалов, которые могут оказывать токсическое действие.

Разработанные противораковые клетки

Если мы сосредоточимся на разработке индивидуальных терапевтических клеток, которые могут воспринимать сигналы болезни и выполнять целенаправленные и точно откалиброванные терапевтические программы, какое поведение мы хотели бы? Иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты или естественные клетки-киллеры, можно модифицировать для идентификации и уничтожения опухолевых клеток.Такие клетки уже можно удалить у пациентов, генетически модифицировать, размножить ex vivo и адаптивно перенести обратно пациенту [16-17]. Противораковая клетка может быть разработана для обнаружения комбинации сигналов, связанных с опухолью, включая специфические опухолевые антигены, гипоксию, органоспецифические антигены, а также специфические факторы роста и цитокины, которые секретируются опухолями, чтобы избежать нормальных иммунных ответов и создать микроокружение, способствующее развитию опухолей [18],. Инженерные клетки, которые распознают эти факторы, но связаны с противоопухолевым ответом, были бы идеальными.Также критически важно разработать внешний контроль (например, небольшую молекулу) или предохранительные переключатели для этих терапевтических клеток, чтобы их поведение можно было отключить или ослабить в ответ на нежелательные побочные эффекты, или чтобы титровать величину их реакции.

Сконструированные клетки, которые обнаруживают эти специфические для опухоли входные данные, могут быть сконструированы для получения ряда различных ответов, таких как производство агентов визуализации, которые помогают в идентификации опухолей и метастазов, и контроль эндогенных иммунных клеточных реакций, таких как хемотаксис, фагоцитоз и убийство клеток.Возможно, наиболее важно то, что эти терапевтические клетки могут быть запрограммированы на секретирование факторов, нарушающих локальное микроокружение опухоли, таких как провоспалительные цитокины и факторы антиангиогенеза, что делает их непригодными для устойчивого роста опухоли. Это было бы эквивалентно созданию специальной иммунной клетки, которая выводит из строя опухолевые клетки и микроокружение на нескольких уровнях.

Направленная иммуносупрессия

Иммунная клетка также может быть разработана для блокирования аутоиммунного заболевания или отторжения трансплантированных органов.Обычная иммуносупрессивная лекарственная терапия имеет широкие и серьезные системные эффекты. Сконструированная клетка может быть запрограммирована на местную иммуносупрессивную реакцию, возможно, в ответ на специфические аутоиммунные антигены или антигены трансплантата в сочетании с цитокиновыми сигнатурами сильного аутоиммунного ответа. Такие клетки могут быть запрограммированы на хемотаксис к участкам этих сигналов и реагировать путем секреции противовоспалительных цитокинов, которые отключили бы воспалительные петли положительной обратной связи, которые обычно приводили бы к полномасштабной аутоиммунной реакции или реакции отторжения.

Хотя индивидуально разработанные терапевтические клетки — это будущее, полезно подумать о том, какое поведение обнаружения и реакции будет ценным, так как они обеспечивают полезные целевые вехи в разработке инструментов и стратегий для перестройки клеток.

Можно ли проектировать сети передачи сигналов сотовой связи?

Существуют большие разногласия относительно того, действительно ли элементы можно спроектировать. Системы клеточной сигнализации настолько тонко оптимизированы, что наше вмешательство приведет к катастрофическим сбоям, или настолько надежно спроектированы эволюцией, что добавление новых генов и сетевых связей не сможет существенно изменить функцию? Очевидно, что эволюция смогла перестроить клеточные сигнальные пути, чтобы получить разнообразные ответы — на определенном уровне они относительно пластичны и эволюционируют.Таким образом, прежде чем пытаться создать новое клеточное поведение, может быть поучительно подумать о том, как эволюция может достичь инновационных новых функций.

Отличительной чертой сигнальных белков, которая, как полагают, играет важную роль в эволюции, является их модульная структура. Они почти всегда состоят из множества модульных доменов, некоторые из которых выполняют каталитическую функцию, а многие — специфические регуляторные функции или функции взаимодействия [19, 20]. Эти модульные домены встречаются в различных сигнальных белках в самых разных комбинациях.Это привело к модели, согласно которой разнообразие сигнальных функций может развиваться посредством рекомбинации этого набора доменов. Таким образом, в принципе, если бы мы могли понять, как эволюция работает с этими модулями, мы могли бы использовать тот же набор инструментов, чтобы найти области пространства поведения, которые эволюция, насколько нам известно, еще не исследовала.

Почему сигнальные белки и системы настолько модульны? Большинство согласны с тем, что в эволюционной временной шкале организмы находятся под давлением приспособленности к развитию инновационных клеточных сигнальных реакций, которые могут привести к преимуществам в изменяющейся окружающей среде и по сравнению с конкурирующими организмами.Под воздействием такого рода изменяющегося давления приспособленности модульные системы могут спонтанно развиваться как способ облегчить более быструю диверсификацию функций [21]. Алон и его сотрудники смоделировали эволюцию биологической сети, используя эволюционные алгоритмы для поиска простых вычислительных сетей, которые решают поставленную цель [22]. Когда они неоднократно меняют целевую цель, результирующие сети спонтанно развивают более модульные решения — сети, которые имеют внутри себя функциональные подсети. Эти заранее сформированные подсети — модули — могут быть быстро переподключены новыми способами для перехода от одной целевой функции к другой.По сути, кажется, что модули предоставляют способ быстро перемещаться из одного функционального пространства в другое, перепрыгивая через обширные области нефункционального сетевого пространства. Таким образом, модульная организация сигнальных белков и сетей может отражать давление на эти системы с целью создания поведения, которое соответствует потребностям постоянно меняющейся среды.

Важность модульности в облегчении эволюции новых функций согласуется с концепциями эволюции и развития, в которых утверждается, что большая часть диверсификации функций и морфологии организмов эволюционирует через альтернативное регулирование существующих компонентов, а не на изобретение принципиально новых компонентов [23].Хотя многие из этих идей были разработаны с упором в первую очередь на регуляцию генов с помощью различных цис-действующих модулей, они также могут применяться к регуляции ключевых каталитических сигнальных модулей с помощью разнообразных локализационных и регуляторных модулей [24,25]. Неудивительно, что многие из усилий по разработке нового сигнального поведения, описанного ниже, используют стратегии рекомбинации модульных функциональных единиц новыми способами, таким образом, по сути, используя эволюционную стратегию для создания новой функции.

Разработка новых сенсорных систем

Одним из наиболее важных инструментов для изменения поведения клеток будет способность создавать новые датчики и рецепторы для целевых входов.Однако это, пожалуй, наименее охарактеризованный элемент в инженерии клеточной сигнализации, потому что вселенная возможных входов настолько обширна и часто включает проблему работы с относительно сложными мембранно-ассоциированными мембранными белками. Ниже мы описываем недавний прогресс в модификации или конструировании различных рецепторных молекул.

Перенаправление выхода естественных рецепторов

Природные рецепторы, которые обнаруживают специфические эндогенные входы, могут быть спроектированы для генерации неродной выходной реакции.Есть несколько примеров перенаправления нативного рецептора, чтобы вызвать новый транскрипционный ответ. Один из таких подходов использует модульную структуру рецепторного белка Notch. Notch — это трансмембранный рецептор, который обнаруживает белок Delta, присутствующий на соседних клетках, — критический канал межклеточной коммуникации в развитии и дифференцировке. Когда Delta связывает Notch, трансмембранная область Notch расщепляется мембранной протеазой, высвобождая C-концевой домен Notch в цитоплазму.Этот домен может проникать в ядро ​​и активировать транскрипцию гена. Struhl et al. Показали, что этот модуль фактора транскрипции рецептора notch может быть заменен синтетическим фактором транскрипции (Gal4-AD), так что при активации in vivo этот химерный рецептор notch может активировать гены, нацеленные на новый фактор транскрипции [26 , 27]. Хотя эту конструкцию использовали в качестве репортера для активации Notch, ее можно было легко использовать для связывания обнаружения нативного дельта-лиганда с совершенно новым набором ненативных генов-мишеней.

Barnea et al. Расширили эту модульную стратегию, вдохновленную Notch, путем создания новых транскрипционных выходов для других рецепторов, которые обычно не используют этот тип механизма активации протеаз [28]. Когда рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), активируются своими специфическими лигандами, они часто рекрутируют β-аррестин, который участвует в подавлении передачи сигналов GPCR. Barnea et al. Слили аррестин с высокоспецифичной протеазой вируса травления табака (TEV), так что он был совместно задействован в активированных GPCR.Синтетический фактор транскрипции также был слит с цитоплазматическим хвостом GPCR, связанным сайтом расщепления TEV. Таким образом, когда сконструированный слитый белок GPCR активируется своим эндогенным лигандом, он рекрутирует партнера протеазы аррестин-TEV, который расщепляет и высвобождает домен фактора транскрипции из GPCR, посредством чего он может проникать в нуклеазу и активировать гены-мишени. Эта система успешно использовалась для связывания новых репортеров транскрипции с активацией широкого спектра специфических GPCR.Ответ очень специфичен благодаря специфичности расщепления TEV. В принципе, эту стратегию можно использовать для связывания любого эндогенного сигнала, опосредованного GPCR, с экспрессией желаемых генов-мишеней.

Barnea et al. Также использовали эту стратегию для связывания передачи сигналов эндогенной рецепторной тирозинкиназы (RTK) с новыми выходами транскрипции [28]. Большинство RTK при стимуляции активируют свои киназные домены, которые опосредуют аутофосфорилирование цитоплазматических тирозинов для рекрутирования белков, содержащих домен Sh3.Здесь протеаза TEV была слита с рекрутированными доменами Sh3, а синтетический фактор транскрипции был слит с цитоплазматическим хвостом RTK через сайт расщепления протеазой TEV. Итак, активация RTK ведет к рекрутированию слияния Sh3-домен-TEV, высвобождению ассоциированного с рецептором фактора транскрипции и транскрипции гена инженерии. Примечательно, что эта простая модульная стратегия может быть применена к нескольким классам рецепторов, если они привлекают определенный белок-партнер при активации.

Howard et al. Использовали модульность передачи сигналов RTK для перенаправления сигнала онкогенного роста на апоптотический ответ [29]. Они сконструировали новый адаптерный белок Sh3, в котором домен Sh3, распознающий активированный RTK, был слит с доменом эффектора смерти от Fadd. Таким образом, активация RTK привела к рекрутированию в мембрану домена смерти, что вызвало ответ клеточной смерти. Возможность увязки других новых результатов с этими ключевыми событиями найма еще недостаточно изучена.

Рецепторы, которые обнаруживают новые входные данные малых молекул

Вышеупомянутые стратегии сосредоточены на способах получения рецепторов, которые обнаруживают эндогенные сигнальные молекулы, и конструируют их так, чтобы вызывать новые ответы. Однако во многих случаях для клеточной инженерии могут потребоваться рецепторы, которые обнаруживают новые сигналы, для которых нет эндогенных рецепторов. Эти новые сигналы включают в себя небольшие молекулы, которые мы можем захотеть обеспечить внешнее управление инженерной системой.

Относительно хорошие успехи были достигнуты в использовании GPCR в качестве платформы для конструирования контролируемых рецепторов на малых молекулах.Некоторые GPCR, такие как опиоидные рецепторы, могут активироваться их эндогенными лигандами и специфическими низкомолекулярными агонистами. Конклин, Рот и его сотрудники сконструировали молекулы, известные как рецепторы, активируемые исключительно синтетическими лигандами (RASSL) [30,32]. Эти рецепторы мутированы так, что они не могут связывать свой эндогенный лиганд, но активируются и вызывают свой эндогенный нисходящий эффект в ответ на небольшой фармакологически инертный молекулярный агонист.

GPCR различаются по своим выходам, отчасти потому, что отдельные рецепторы связываются со специфическими гетеротримерными G-белками.Дальнейшая разработка дала версии RASSL, которые специфически связаны с каждым из этих отдельных нисходящих путей, тем самым позволяя малым молекулам контролировать очень разнообразный набор выходов. Эти RASSL были успешно применены у трансгенных мышей — по сути, перестраивая передачу сигналов в полноценном живом организме — в основном в качестве диагностического и аналитического инструмента. Применение было разнообразным, учитывая широкое использование GPCR в разных тканях. Например, мыши, несущие вкусовые нейроны, экспрессирующие RASSL, проявляли специфические сладкие (привлекательные) или горькие (аверсивные) ответы на воду, смешанную с агонистом (спирадолином), в зависимости от того, в каком типе нейрона они экспрессировались [33].Кроме того, экспрессия RASSL в клетках сердца позволяет контролировать частоту сердечных сокращений путем введения спирадолина [34]. То, что эти рецепторы in vivo так надежно работают, , намекает на их потенциальную полезность в более сложной клеточной инженерии.

Химические димеризаторы образуют другую стратегию достижения контроля малых молекул над передачей сигналов. Такие стратегии были рассмотрены в другом месте [35,36] и не будут здесь обсуждаться.

Рецепторы, которые обнаруживают определенные пользователем антигены

Было бы идеально разработать рецепторы, которые могут воспринимать ассоциированные с заболеванием антигены, такие как белок, сильно экспрессирующийся в опухоли или инфекционном агенте.Если бы рецепторы могли быть сконструированы для достижения такого же разнообразия и избирательности распознавания, что и антитела, можно было бы обнаруживать широкий спектр входных сигналов и связывать их с конкретными ответами. Химерные антигенные рецепторы (CAR) — рецепторы, созданные с использованием одноцепочечных антител (scFv) как часть механизма их обнаружения, — были разработаны как универсальный каркас этого типа. Эта стратегия проистекает из модульности рецепторов иммунных клеток, таких как рецептор Т-клеток. Хотя Т-клеточный рецептор представляет собой сложный мультибелковый комплекс, сшивания цитоплазматической области субъединицы дзета-цепи CD3 достаточно для индукции передачи сигналов Т-клетками [37].Дзета-цепь CD3 содержит мотивы, которые фосфорилируются при активации тирозинкиназами, такими как Lck, для индукции рекрутирования белков, содержащих домен Sh3, таких как киназа ZAP-70. Слияние цитоплазматической области дзета-цепи CD3 с внеклеточным одноцепочечным антителом (scFv) дает рецептор, часто называемый «Т-тельцем», который при экспрессии в Т-клетках приводит к целенаправленному уничтожению клеток, экспрессирующих узнаваемый антиген (предположительно, поверхностные антигены сшивают и активируют химерные рецепторы) [38,39].Слияние scFv с внутриклеточной областью рецептора Fc (гамма-цепь) может дать химерный антиген-чувствительный рецептор аналогичного типа. Эти исследования подчеркивают модульность этих рецепторов: соединение нового внеклеточного распознающего элемента с нижележащими внутриклеточными сигнальными элементами приводит к новому датчику ввода / вывода.

Эти CAR первого поколения относительно примитивны и дали неоднозначные результаты. Т-клетки, экспрессирующие CAR, направленные против опухолевых антигенов, обладают умеренной сигнальной способностью по сравнению с эндогенными ответами TCR, умеренно пролиферируют ex vivo и in vivo и имеют низкую выживаемость при многократном воздействии антигена [16,17]].Улучшения в этом поведении были сделаны путем включения дополнительных модульных доменов во внутриклеточные области CARs, включая домены от молекул корецепторов, которые являются частью нормальной активации TCR, таким образом, возможно, имитируя более полную активированную внутриклеточную сборку [40,41]. Клетки, содержащие CAR следующего поколения, более эффективно контролируют опухоли ксенотрансплантата у мышей, и в настоящее время переносятся на клинические испытания [16]. Более сложная инженерия CAR может привести к еще большему улучшению терапевтической функции.

Датчики, которые обнаруживают физические сигналы, такие как свет

Еще одна интересная область исследований — разработка генетически закодированных датчиков, которые могут обнаруживать свет и преобразовывать его в конкретный биологический ответ, область, называемая оптогенетикой. Встречающиеся в природе светочувствительные белки растений, водорослей и бактерий можно модифицировать для использования в высших организмах, включая млекопитающих. Эти инструменты чрезвычайно полезны в качестве пространственно-временных шкал для контроля и анализа сложного клеточного и организменного поведения, особенно когда они экспрессируются с помощью промоторов, специфичных для клеточного типа.В долгосрочной перспективе оптогенетические инструменты могут использоваться для удаленного контроля клеток, используемых в терапевтических целях, хотя существуют серьезные технические проблемы, такие как то, как свет может доставляться в организм, которые необходимо будет преодолеть. Наиболее часто используемые сегодня оптогенетические инструменты — это белки микробного канала родопсин и галородопсин, которые широко используются для контроля функции нейронов. Они рассмотрены в другом месте [42] и не будут здесь подробно обсуждаться.

Совсем недавно появились дополнительные оптогенетические инструменты, которые могут быть применены к более широкому спектру клеточных сигнальных систем.Airan et al. Сконструировали набор активируемых светом GPCRs, которые могут связываться как с нижележащими Gs, так и с гетеротримерными G-белками Gq [43]. Были созданы химеры светочувствительной зрительной системы GPCR, родопсин (бычий), которые содержат внутриклеточные петли от Gq- и Gs-сопряженных адренергических рецепторов. Эндогенная молекула сетчатки — это светочувствительный хромофор. Эти новые инструменты значительно расширяют «словарь» передачи сигналов, которым можно управлять с помощью света, учитывая важность путей передачи сигналов Gq и Gs в различных типах клеток.

Еще более обобщенная стратегия управления светом включает использование контролируемых светом белковых взаимодействий. Временное взаимодействие конкретных белков-партнеров является основой многих внутриклеточных сигнальных событий (см. Ниже), и рецепторы могут быть обойдены, так что свет напрямую контролирует такие внутриклеточные взаимодействия. Левская и др. Использовали систему взаимодействия фитохрома, полученную из растений — связывание этого фоторецептора с его партнерским доменом PIF может включаться и выключаться с помощью определенных длин волн света — для рекрутирования определенных белков на мембрану точным пространственно-временным образом [44].В случае факторов обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), которые контролируют GTPases семейства Rho, это может быть использовано для запуска активации GTPase и последующих изменений цитоскелета, приводящих к световодному выпячиванию клеток. Хотя этот метод является мощным и потенциально применимым ко многим сигнальным взаимодействиям, система Phy-PIF требует добавления проницаемого для клетки хромофора, который не является эндогенным для клеток млекопитающих. Wu et al. Использовали светочувствительный домен LOV (свет-кислород-напряжение) (обнаруженный в растениях, водорослях и бактериях) для конформационной закупорки Rac GTPase контролируемым светом способом [45].Этот связывающий флавин домен обеспечивает еще один потенциально общий конформационный элемент управления светом, который может быть связан для управления различными сигнальными белками.

Инженерные системы обработки сигналов

В конечном итоге клетки решают, какие программы ответа выполнять на основе внутриклеточных сигнальных сетей, которые принимают и обрабатывают сигналы от сенсорных молекул (см. Выше). Недавняя работа в области сотовой инженерии была сосредоточена на понимании того, как эти сети функционируют для принятия решений и как их можно изменить.

Модульная логика обработки сигналов

Внутриклеточные сигнальные белки имеют высокую модульность (см. Выше). Большинство модулей делятся на два класса (). Первый класс — это ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, которые катализируют посттрансляционные модификации или конформационные изменения, с помощью которых сохраняется информация. В большинстве случаев эти каталитические домены входят в пары: ферменты-писатели (например, киназы) производят модификацию, а ферменты-стиратели (например, фосфатазы) удаляют модификацию.Второй класс — это регуляторные домены или домены взаимодействия, которые модулируют активность каталитических доменов или нацеливают их на конкретных партнеров или сайты в клетке. Эти модули могут опосредовать специфические белок-белковые взаимодействия (либо конститутивные взаимодействия, либо те, которые зависят от посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование) или белок-мембранные взаимодействия. Таким образом, именно регуляторные домены и домены взаимодействия определяют, когда и где активируются каталитические домены и каким партнерам они передают информацию [5].

a | ферментных и регуляторных доменов . Модульные сигнальные белки эукариот обычно состоят из ферментативных доменов и доменов локализации. Ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, а также GEF и GAP, катализируют регуляторные модификации, такие как фосфорилирование и активация GTPase, соответственно (ферментные домены часто входят в пары «писатель» и «стиратель», которые имеют противоположные активности).Эти ферментные домены регулируются и нацелены на домены взаимодействия, включая домены межбелкового взаимодействия, домены мембранного взаимодействия или трансмембранные домены.

b | различных классов многодоменных архитектур . Ферментативные домены могут быть непосредственно нацелены на определенные субстраты, партнеров или субклеточные участки посредством доменов взаимодействия. В качестве альтернативы они могут быть косвенно нацелены через адаптеры или белки каркаса, которые содержат несколько доменов взаимодействия.Домены взаимодействия могут также аллостерически регулировать каталитические домены, участвуя во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях. Такие переключающие белки могут быть активированы конкурирующими лигандами, которые снимают аутоингибирование.

Эти разные классы модулей обнаруживаются в различных комбинациях и расположениях в сигнальных белках (). Каталитические домены, слитые с нацеливающими доменами, могут быть задействованы в определенных комплексах или участках мембраны, где они будут модифицировать определенные мишени; часто эти каталитические домены имеют высокую внутреннюю константу Михаэлиса (Km’s и, следовательно, требуют нацеливания с помощью дополнительных доменов взаимодействия для эффективного катализа.Иногда эти нацеленные взаимодействия регулируются, если, например, взаимодействие зависит от посттрансляционной модификации, такой как нацеливание белков домена Sh3 на аутофосфорилированные сайты pTyr на активированных RTK. Белки с двумя доменами взаимодействия могут действовать как адаптеры, которые переводят одно взаимодействие во второе, что приводит к увеличению гибкости ответа в зависимости от адаптерных белков, которые экспрессируются в конкретном типе клеток. Белки с множественными доменами взаимодействия могут также функционировать как скаффолдные белки, которые организуют несколько белков на пути в комплекс.Эти взаимодействия могут быть конститутивными или предопределенными, или индуцированными такими факторами, как фосфорилирование или конформационные изменения, которые открывают сайты взаимодействия. Таким образом, каркасные белки могут в принципе определять проводные связи сигнальных белков, а также контролировать, когда и где происходит передача сигналов [24, 20].

Вторая важная роль взаимодействия и регуляторных доменов — это непосредственный контроль активности каталитических доменов. Во многих случаях домены взаимодействия участвуют во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях, которые стерически закрывают каталитический домен или конформационно возмущают его — тип регуляции, называемый модульной аллостерией [46].Связывание конкурирующих межмолекулярных лигандов с доменами взаимодействия индуцирует каталитическую активность белков. Часто множественные домены взаимодействия участвуют в автоингибировании каталитического домена кооперативным или иерархическим образом [47, 48]. Эти белки могут функционировать как сложные переключатели с множеством входов, которые требуют определенной комбинации входов для правильной активации. Кроме того, поскольку внешние лиганды активируют эти белки, локализация (управляемая этими взаимодействиями) может быть напрямую связана с активацией.

Разработка новых белковых переключателей

Лим и его сотрудники исследовали, можно ли использовать модульную аллостерическую логику многих природных эукариотических сигнальных белков для создания новых сигнальных переключателей путем рекомбинации доменов (). В самом деле, каталитические домены актинового регуляторного белка N-WASP и GEF семейства Rho могут быть связаны с новыми аутоингибиторными доменами с образованием белков, активность которых регулируется новыми лигандами [49,50]. Внутримолекулярное связывание любого из этих каталитических доменов с доменом PDZ и пептидом лиганда PDZ может давать переключатель, который активируется конкурирующим пептидом PDZ.Точно так же можно добавить несколько доменов взаимодействия, чтобы получить комбинаторный переключатель, отображающий управление логическим элементом И. В зависимости от точной конфигурации доменов и внутримолекулярных взаимодействий типы регуляции могут быть разными в ответ на разные конкурирующие внешние лиганды — один лиганд может активировать белок, а другой репрессировать его. Эти типы разнообразных взаимоотношений между регуляторными доменами напоминают разнообразное поведение, наблюдаемое в природных сигнальных белках, подтверждая представление о том, что этот вид архитектуры переключения облегчает эволюцию разнообразных комбинаторных регуляторных переключателей [48].Dueber et al. Также показали, что синтетические аутоингибирующие переключатели, использующие поливалентные взаимодействия одного и того же типа, приводят к переключениям, поведение активации которых может быть настроено кооперативно от линейного до цифрового ответа [51].

a | инженерных переключателей аллостерических белков . Dueber et al [49,51] показали, что аллостерическая регуляция сигнального белка N-WASP может быть перепрограммирована путем рекомбинации каталитического домена из N-WASP с различными комбинациями доменов взаимодействия.Новые модели поведения включали управление с множеством входов (логический элемент И) и активную активацию, подобную переключателю.

b | с использованием белков каркаса в качестве молекулярной печатной платы для преобразования выходных сигналов . Связь входа / выхода киназного пути MAP в дрожжах может быть перенаправлена ​​через сконструированный химерный каркас, который собирает новую комбинацию киназ [58]. Новые сайты взаимодействия также могут быть добавлены к каркасам для привлечения дополнительных модулирующих факторов.Эти дополнительные факторы могут быть построены синтетическими петлями обратной связи, которые могут быть использованы для создания путей, которые отображают разнообразную динамику передачи сигналов [62].

Каркасные белки как молекулярные схемы

Цепи внутриклеточной передачи сигналов также можно напрямую контролировать, используя регуляторные взаимодействия для перепрограммирования соединений путей. Например, каталитический домен киназы семейства Src, Hck, который обычно регулируется доменами Sh3 и Sh4, может быть слит с доменом PDZ и направлен in vivo для специфического фосфорилирования субстратов с мотивом лиганда PDZ [52].

Белки каркаса также могут быть использованы для создания новых взаимосвязей между входом и выходом пути. У дрожжей существует множество функционально различных киназных путей митоген-активированного протеина (MAP), которые регулируют ответы на феромон спаривания и осмотический стресс [53,54]. Эти пути имеют общие компоненты киназ, но остаются специфическими, потому что каждый путь организован отдельным каркасным белком [55–57]. Химерный каркасный белок, который организует избранных членов путей спаривания и осмотического стресса, дает неприродный путь, в котором феромон спаривания специфически индуцирует программу реакции осмостресса в vivo [58].Подобные ковалентные слияния, которые, подобно каркасу, вызывают взаимодействие между двумя сигнальными белками, могут быть использованы для принудительной передачи сигнала по единственному пути [59].

Совсем недавно было показано, что каркасные белки не только опосредуют линейные отношения ввода / вывода путей, но также координируют набор модуляторных факторов, которые формируют дозовую зависимость и динамику ответа пути [60,61]. Вдохновленный этими природными примерами, Башор и др. Показали, что дрожжевой скаффолд MAP-киназы, белок Ste5, можно использовать в качестве молекулярной печатной платы, чтобы гибко изменять количественное поведение реакции спаривания [62].Слияние дополнительного сайта синтетического взаимодействия с каркасом Ste5 (с использованием пары гетеродимеров лейциновой застежки) способствует привлечению новых модулирующих факторов, таких как фосфатаза MAPK, которая подавляет ответ пути. Однако, если экспрессия и рекрутирование фосфатазы связаны с выходным сигналом пути, возникает петля отрицательной обратной связи, которая приводит к адаптации — временный ответ, за которым следует автоматический возврат к более низким уровням выхода, что является ключевым поведением во многих биологических сенсорных системах.Связывая по-разному положительные и отрицательные модуляторы пути, этот небольшой набор элементов управления каркасом может быть использован для генерации очень разнообразных дозовых реакций и динамического поведения, включая высоко кооперативное переключение, отложенные ответы, ускоренные ответы и генерацию импульсов. Эти исследования показывают, как организующие центры, такие как каркас, являются богатой платформой для обработки и формирования внутриклеточной передачи сигналов посредством эволюции или инженерии.

Инженерная пространственная самоорганизация

Один из наиболее плохо изученных аспектов передачи сигналов в клетке — это то, как контуры, состоящие из диффундирующих молекул, могут приводить к высокоточной пространственной организации в клетке, такой как направленная поляризация и миграция.Этот тип самоорганизации является аспектом схемы управления, где нет хороших электронных или инженерных аналогов, и где биология может обучать инженерии.

Инженерные принципы применяются для понимания механизма поляризации почкующихся дрожжей, S. cerevisae . Поляризация контролируется GTPase Cdc42, которая в конечном итоге локализуется в одном сайте материнской клетки, приводя к образованию единственной почки, которая врастает в дочернюю клетку [63].Примечательно, что этот процесс приводит к образованию единственной бутоны почти со 100% надежностью. Цепь положительной обратной связи с участием Cdc42 GTPase является ключевой в поляризации: активный Cdc42 на мембране рекрутирует цитоплазматический белок GEF Bem1, который активирует и локализует дополнительный Cdc42 [64]. Хотя этот вид петли обратной связи ведет к образованию фокусов Cdc42, быстрая диффузия и перераспределение Bem1 между конкурирующими фокусами может быть важным, чтобы позволить одному из фокусов стать доминирующим, что ведет к сингулярности почкования.Эффект замедления диффузии и перераспределения Bem1 за счет связывания его с трансмембранным мотивом был проанализирован [65]. Bem1, привязанный к мембране, может спасти летальность от нокаута Bem1, но не может подвергаться диффузии в цитоплазме. Вместо этого он доставлялся к плазматической мембране в везикулах через актиновые кабели (также координируемые фокусами Cdc42) и от мембранных фокусов посредством эндоцитоза и, таким образом, перераспределялся намного медленнее. Наблюдались серьезные дефекты сингулярности, такие как множество устойчивых конкурирующих фокусов Cdc42, и частота многопочкованных клеток увеличивалась до ~ 5%.Подобные исследования помогают выявить требования к точно контролируемой пространственной самоорганизации и предполагают, что мы можем научиться создавать сигнальные цепи, которые производят индивидуальные пространственные результаты с важным терапевтическим поведением (например, регенеративная медицина, которая требует определенной клеточной морфологии и ориентации).

Создание предсказуемой инженерии передачи сигналов

Исследования, приведенные выше, показывают, что сигнальные системы являются высокомодульными и пластичными и рекомбинирующие модули, особенно каталитические домены с новыми регуляторными доменами, могут приводить к отличному ответному поведению.Таким образом, вопрос уже не в том, можно ли спроектировать сигнальные системы для получения нового поведения, а в том, можно ли их спроектировать таким образом, чтобы мы могли предсказать, какое поведение проявится и насколько успешной будет каждая спроектированная схема.

Проблема непредвиденных перекрестных помех

Одна из основных проблем, связанных с передачей сигналов инженерной клетки, заключается в том, что естественные компоненты — инструментарий доступных доменов — повторно используются, что может привести к непредвиденным перекрестным помехам. Приведут ли инженерные взаимодействия, которые вы создаете, к специфическому фосфорилированию желаемого белка, или используемый домен также будет перекрестно взаимодействовать с другими мишенями, конкурентно титруя важные физиологические взаимодействия и приводя к непредвиденным эффектам или сбоям в спроектированной схеме? Часто природные части не обладают абсолютной специфичностью, и эволюция, скорее всего, использует сложные сети перекрестной реактивности, чтобы обеспечить важную скоординированную регуляцию.Хотя такая сложная система, похожая на нейронную сеть, может обеспечить преимущества для клетки, это проклятие для прогнозной инженерии.

Представляя будущий инструментарий сигнализации

Одним из решений этой проблемы является сборка инструментария из деталей, специально оптимизированных для проектирования. Этот вопрос важен для любого типа сигнальной части, но мы сосредоточимся на том, как собрать полезный инструментарий из частей, взаимодействующих с белками ().

Нативная клетка имеет свой собственный репетитор модулей взаимодействия с белками, и поэтому сложно разработать новые функции с использованием связанных модулей взаимодействия, которые могут показывать непреднамеренные и непреднамеренные перекрестные помехи в камере.Оптимизированный набор взаимодействующих частей может значительно повысить предсказуемость клеточной инженерии, исключив возможность непреднамеренных перекрестных помех. Несколько стратегий оптимизации включают разработку модулей взаимодействия, которые используют неиспользованную специфичность; разработка составных, многодоменных взаимодействий; объединение модулей взаимодействия с новым субклеточным нацеливанием; и импорт модулей ортогонального взаимодействия (либо созданных синтетически, либо из других организмов), которых нет в клетке-хозяине.

Хотя природа неоднократно использовала семейства частей, такие как домены взаимодействия определенного типа, недавние исследования показывают, что в некоторых случаях члены семейства содержат неиспользуемые сайты узнавания внутри этих доменов. Их можно использовать для создания пар домен-пептид, которые одновременно оптимизированы для взаимодействия со своим правильным партнером, избегая при этом перекрестного взаимодействия с другими членами семейства [66,67]. Фактически были сконструированы пары PDZ-домен-лиганд и гетеродимеризующиеся пары лейциновой застежки-молнии, которые оптимизированы, чтобы избежать перекрестной реакции с естественными доменами того же типа [68,69].Избирательность и предсказуемость существующих доменов взаимодействия также можно улучшить путем разработки составных взаимодействий. Конечно, многодоменное сотрудничество — естественный механизм повышения специфичности. Но новый поворот в этом вопросе — это разработка составных двухкомпонентных взаимодействий типа «раскладушка». Koide et al. Взяли домен PDZ и слили его с доменом фибронектина [70]. Используя фаговый дисплей, они отобрали варианты этого тандемного домена, которые связывают определенный пептид, так что он находится между двумя доменами.Резко увеличенная площадь распознавания приводит к взаимодействиям с гораздо более высокой специфичностью и сродством. Другое решение для специфичности, которое наблюдается в природе, — это дифференциальная компартментализация. Если нацеливающие мотивы могут быть использованы для локализации партнерских белков в определенных органеллах или клеточных участках, то мотивы взаимодействия, вероятно, будут функционировать более специфическим образом, особенно если в этом месте или органелле происходит мало или совсем не происходит конкурирующих взаимодействий этого типа.

Альтернативный подход к достижению надежной специфичности заключается в импорте доменов из других организмов, которых нет в создаваемом хозяине. Напр., PDZ домены могут быть импортированы в дрожжи (у которых отсутствует большинство таких доменов), хотя возможность случайных перекрестных реагирующих партнеров не может быть исключена [58]. Примером ортогональной молекулярной системы, которая была успешно перенесена на нового хозяина, является бактериальная рекомбиназная система Cre-Lox, которая надежно используется для создания сложных хромосомных перестроек в сложных организмах, включая мышей [71].

Таким образом, представляя инструментарий будущего, можно захотеть создать набор из десяти или около того пар взаимодействия белков, оптимизированных для конкретного выбранного организма (например, E.coli , S.cerevisae , млекопитающие) в том, что они ортогональны, то есть известно, что они не реагируют перекрестно с протеомом хозяина или белками в наборе инструментов, за исключением их родственного лиганда. Также важно, чтобы эти взаимодействия были настраиваемыми, поэтому серия лигандов для каждого домена взаимодействия, которые различаются по аффинности на несколько порядков, были бы идеальными.Это позволило бы систематически исследовать, как сродство вербовки меняет поведение системы.

Комбинаторный дизайн и прогнозирование

Другой другой, но все же дополнительный подход к предсказуемому проектированию передачи сигналов соты состоит в использовании комбинаторной изменчивости. В ходе естественной эволюции рекомбинация сигнальных модулей для генерации новой функции, по-видимому, не была спроектирована или направлена, а скорее была относительно случайной, и именно естественный отбор выявил события перепрограммирования, которые привели к преимуществам приспособленности.Таким образом, очень плодотворным подходом, учитывая отсутствие предсказуемости в клеточной инженерии, могло бы быть построение комбинаторных библиотек синтетических схем и выбор желаемой функции [25,72]. Более того, этот подход можно было бы комбинировать с полу- прогнозное проектирование, при котором могут быть разработаны общие архитектуры спроектированных схем, но комбинаторные методы используются для поиска в более широком диапазоне пространства параметров (с использованием вариантов каждого модуля в библиотеке). Сосредоточение внимания на комбинаторном выборе может также обеспечить очень полезную стратегию на заре синтетической биологии, поскольку это может помочь нам быстрее узнать о основных принципах проектирования.

Outlook

Цель понимания того, как клетки общаются и принимают решения, остается очень привлекательной, особенно потому, что понимание молекулярного языка внутри клетки может позволить нам общаться с клетками и инструктировать их выполнять новые запрограммированные функции. Наша способность перестраивать клеточную сигнализацию может обеспечить множество мощных приложений, таких как терапевтические клетки, запрограммированные на обнаружение селективного набора сигналов, связанных с заболеванием, и на локальный ответ точно настроенным образом.

Хотя эволюция достигла такого рода инноваций и точной инженерии клеточных функций, мы только начинаем понимать, как достичь такого рода цели. У нас есть хорошее фундаментальное понимание логики клеточных сигнальных механизмов и источников функциональной пластичности. Кроме того, были сделаны первые важные шаги в разработке новых рецепторно-сенсорных систем, а также новых или модифицированных схем обработки внутриклеточных сигналов. Несмотря на эти инструменты, на сегодняшний день было приложено очень мало усилий для того, чтобы связать эти типы компонентов новыми способами, чтобы получить более крупные интегральные схемы, способные давать очень точные и точные отклики.Такие усилия продолжаются. Например, Cell Propulsion Lab — это наномедицинский центр Национального института здравоохранения (http://nihroadmap.nih.gov/nanomedicine/devcenters/cellularcontrol.asp), который пытается использовать относительно простые противоопухолевые иммунные клетки, созданные с использованием синтетических рецепторов химерных антигенов ( CAR), и улучшают обработку их сигналов и набор ответов, которые они вызывают, чтобы оптимизировать клетки для экспансии ex vivo, , in vivo, выживания, противоопухолевой цитотоксичности и нарушения благоприятного микроокружения опухоли.Будет интересно увидеть, как будут развиваться эти типы усилий и как эти проблемы повысят сложность и надежность сотовой инженерии.

a | перенаправление собственных входов на новые выходы . С-концевой домен рецептора notch представляет собой фактор транскрипции, который высвобождается в результате трансмембранного протеолиза при активации лигандом дельта. Замена альтернативным доменом фактора транскрипции дает новый ответ экспрессии гена [26].Выход рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), может быть перенаправлен аналогичным образом путем слияния домена фактора транскрипции через привязку с сайтом протеазы TEV. Активация GPCR приводит к привлечению белка аррестина. Если в клетке экспрессируется слияние протеазы аррестин-TEV, активация GPCR приводит к высвобождению фактора транскрипции и новому выходу экспрессии гена [28]. Таким образом, активация GPCR может быть произвольно связана с новым транскрипционным выходом. Выход рецепторной тирозинкиназы (RTK) может быть перенаправлен за счет привлечения синтетических адаптеров домена Sh3 или PTB к активированному и фосфорилированному тирозин рецептору.Домен Sh3 может быть использован для рекрутирования протеазы TEV (чтобы снова высвободить искусственно связанный транскрипционный домен) [28] или для рекрутирования новых эффекторных доменов, таких как те, которые участвуют в гибели клеток [29].

b | инженерный новаторский контроль ввода для собственных ответов . GPCR были сконструированы так, чтобы их контролировали низкомолекулярные агонисты путем мутации их внеклеточной поверхности, так что они больше не связывают свои эндогенные лиганды (рецепторы, активируемые исключительно синтетическим лигандом — RASSL [32]).Рецепторы, которые активируют Т-клетки в ответ на произвольные входные данные, могут быть созданы путем слияния сконструированных одноцепочечных антител (scFv) с внутриклеточной областью Т-клеточного рецептора (дзета-цепь CD3), которые называются рецепторами химерных антигенов (CARs [16, 17]). Событие передачи сигнала, опосредованное рекрутингом, может быть помещено под световой контроль путем замены эндогенного взаимодействия на светозащитное взаимодействие, пара взаимодействий Phytochrome-PIF от растений [44].

a | Цепь поляризации дикого типа контролирует образование одиночных почек. В почкующихся дрожжах локализованная активация полярности GTPase Cdc42 усиливается петлей положительной обратной связи — активный Cdc42 рекрутирует каркасный белок Bem1, совместно собирает активированную p21 киназу (PAK — Ste20) и Cdc42 GEF (Cdc24). Хотя клетка может иметь несколько фокусов Cdc42, они быстро распадаются на один доминантный фокус, который развивается только в клетки. Предполагается, что быстрая скорость обмена диффундирующим комплексом Bem1 / PAK / GEF между конкурирующими фокусами Cdc42 является критической для разделения в один доминантный фокус.

b | синтетическая цепь медленной поляризации приводит к образованию множественных бутонов . Чтобы проверить эту гипотезу, Bem1 был искусственно привязан к мембране через слитый мотив нацеливания на мембрану [65]. Хотя этот связанный с мембраной Bem1 может должным образом собирать комплекс Bem1 / PAK / GEF на участках активности Cdc42 (т.е. петле положительной обратной связи), обмен комплексом между конкурирующими фокусами Cdc42 происходит медленно (зависит от везикулярного транспорта через актиновые кабели и эндоцитоза) .Эта синтетическая поляризационная схема, следовательно, приводит к плохому разрешению конкурирующих фокусов Cdc42 и гораздо более высокой частоте (5% против ~ 0%) многопучковых клеток (микрофотографии из [65]).

Ссылки

Разработка индивидуальных сигнальных цепей клеток

Nat Rev Mol Cell Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 8 ноября.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC2975372

NIHMSID: NIHMS246517

Wendell A.Lim

HHMI и отдел клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF, The Cell Propulsion Lab, NIH Nanomedicine Development Center, NSF Synthetic Biology Engineering Research Center

Венделл А. Лим, HHMI и отдел клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF , Лаборатория движения клеток, Центр разработки наномедицины NIH, Исследовательский центр синтетической биологии NSF;

Abstract

Живые клетки развили широкий спектр сложных сигнальных реакций, которые позволяют им выживать в различных условиях окружающей среды и выполнять определенные физиологические функции.Наше все более сложное понимание молекулярных механизмов клеточных сигнальных сетей у эукариот выявило удивительно модульную организацию, и синтетические биологи изучают, как это можно использовать для создания клеток с новым сигнальным поведением. Этот подход начинает раскрывать логику того, как клетки могут развивать инновационные новые функции, и подталкивает нас к захватывающей возможности создания пользовательских клеток с точными функциями восприятия и реакции, которые могут быть полезны в медицине и биотехнологии.

Ключевые слова: передача сигналов клеток, инженерия, синтетическая биология, терапевтический, MAP-киназа, каркас, модули, белковые взаимодействия, N-WASP, рецепторы, GPCR, Notch, RTK, рак, адоптивная иммунотерапия, химерные антигенные рецепторы, Т-клетки. , оптический контроль, биопродукция

Живые клетки — это высокодинамичные системы, которые используют сложные молекулярные сигнальные цепи для мониторинга внешнего и внутреннего состояния и выполнения соответствующих физиологических реакций. Как и любая сенсорная машина, созданная или созданная человеком, эти клеточные сигнальные цепи содержат подсистемы принятия решений, которые действуют как сенсоры и процессоры (например, рецепторы и их последующие эффекторы), которые в конечном итоге контролируют различные подсистемы ответа (такие как транскрипция генов и динамика цитоскелета) ( ).Основная цель современной клеточной биологии — понять, как эти молекулярные сигнальные системы достигают своих сложных ответов, которые оптимально настроены для их физиологической роли. Хотя подавляющее большинство исследований нацелено на анализ, картирование и анализ сигнальных сетей клеток, наше растущее понимание того, как работают эти системы, привело к появлению радикально нового подхода — усилий по разработке и созданию собственных синтетических сигнальных цепей [1,2 ].

a | Клетки обычно воспринимают стимулы окружающей среды через рецепторы и другие датчики .Затем эта информация обрабатывается внутриклеточными сигнальными сетями, которые, в свою очередь, задействуют различные клеточные продукты, включая экспрессию генов, секрецию, изменения цитоскелета и рост клеток.

b | Некоторые из основных проблем в развитии или разработке новых сигнальных цепей: : достижение правильной связи определенных входов и конкретных выходов; настройка количественного поведения сигнального ответа — доза-реакция и динамика — так, чтобы они были оптимальными для физиологической функции; и создание устойчивых пространственно самоорганизующихся процессов, таких как процессы, связанные с поляризацией клеток, направленной подвижностью, делением клеток и компартментализацией клеток.

Здесь мы сосредоточимся на синтетической биологии передачи сигналов и посмотрим, как можно спроектировать сигнальные схемы эукариотических клеток для создания клеток с заданным поведением передачи сигналов. Эукариотические клетки используют сети сигнальных белков, чтобы ощущать окружающую их среду и обеспечивать быстрые ответы. Поскольку сети обработки сигналов в клетках функционируют в трехмерном пространстве, они также контролируют сложные пространственные или морфологические клеточные реакции. Мы рассмотрим, как могут быть созданы сигнальные цепи с точным поведением реакции, учитывая, как определяется специфичность ответа (то есть, какие наборы выходных сигналов связаны с конкретным входом), как точно настроенная доза-реакция или временная динамика профили ответов оптимизированы для конкретных физиологических функций и того, как можно достичь сложного пространственного и морфологического контроля ().Мы также рассмотрим, почему появились усилия по разработке и созданию специализированных синтетических сигнальных цепей, как они могут обеспечить более глубокое видение принципов и механизмов разработки молекулярных сигнальных систем и как индивидуализированные реакции на поведение могут быть применены в медицине и биотехнологии. Наконец, мы рассматриваем, как в будущем могут быть разработаны инструменты и методы, которые упростят разработку клеточного поведения.

Почему инженерная сигнализация ячейки?

Прежде чем рассматривать конкретные примеры сконструированных сигнальных путей, полезно обсудить мотивацию инженерии клеточной сигнализации.Попытка создать новое сигнальное поведение в клетках может показаться смелой и глупой целью, учитывая, что у нас еще нет полного или надежного предсказательного понимания естественных сигнальных цепей клеток. Однако разработка клеточной сигнализации — это не просто процесс применения уже хорошо разработанного понимания, но она предлагает подход к «пониманию через построение». В то время как биология традиционно была наукой анализа и деконструкции для выявления генов и молекул, которые важны для конкретного процесса, синтетическая биология предлагает обратный подход, фокусируясь на том, как отдельные молекулярные части могут быть собраны в системы, которые выполняют сложное поведение.Поскольку в настоящее время у нас есть полностью секвенированные геномы и огромное количество протеомных данных, нам не хватает не полного списка молекулярных частей, а скорее понимания того, как эти части сочетаются друг с другом функционально согласованным образом. Разработка новых сигнальных сетей клеток предлагает нам подход к тестированию и расширению нашего понимания принципов организации сложных молекулярных систем.

В этом смысле синтетическая биология передачи сигналов не просто ориентирована на достижение цели приложения, такой как построение клетки с целевой функцией, но также является исследовательской наукой, в которой важно понимать, какие конструкции «работают». и как они соотносятся с «неработающими» дизайнами.Если, например, у кого-то есть естественная сигнальная сеть, которая выполняет сложное представляющее интерес поведение, традиционная генетическая деконструкция может использоваться для идентификации молекул и связей, которые необходимы и важны для функции (). Однако затем можно использовать синтетические подходы для систематического изучения многих типов изменений — альтернативных сетевых связей, настройки силы связей, добавления новых связей — для проверки того, какие сети совместимы с этим интересующим поведением. Анализируя естественную сеть или проектируя единственную успешную схему, вряд ли можно получить более глубокое понимание функционального ландшафта, которое может дать более полное и систематическое исследование синтетической схемы () [3–5].В этом смысле попытки спроектировать клеточное поведение сродни ранней истории синтетической органической химии, где синтез новых или модифицированных молекул обеспечил дополнительный подход к химическому анализу в развитии фундаментальных теорий химической связи, структуры и реакционной способности [ 6]

и | понимание принципов дизайна. Традиционно для анализа сигнальной сети используются такие методы, как нарушение гена.Синтетические подходы предлагают дополнительную информацию, создавая альтернативные версии сети, которые различаются как подключением к сети, так и мощностью каналов. Сопоставляя пространство функциональных (красные кружки) и нефункциональных (синие кружки) вариантов, можно получить более глубокое понимание функциональных требований.

b | конструирует дизайнерские сигнальные пути для терапевтических или биотехнологических приложений. Мы надеемся собрать набор сигнальных модулей, которые можно использовать для создания ячеек со спроектированными сигнальными ответами.Противораковая клетка может обнаруживать комбинацию сигналов опухоли и давать такие ответы, как выработка реагентов для визуализации, уничтожение клеток или секреция факторов, нарушающих микросреду опухоли. Такая ячейка может также иметь предохранительные выключатели, которые могли бы отключить ячейку при необходимости. Иммуносупрессивная клетка может обнаруживать комбинацию аутоиммунного ответа или сигналов отторжения трансплантата и запускать локальные контрмеры, такие как секреция противовоспалительных цитокинов. Интеллектуальная биопродуктивная (ферментационная) клетка будет спроектирована так, чтобы точно модулировать поток роста по сравнению с производственными путями в ответ на стрессовое состояние клетки, тем самым оптимизируя общий урожай.

Изучение пластичности сигнальных путей и того, как их функции могут быть настроены, также имеет отношение к патологии и лечению заболеваний. Многие виды рака обладают онкогенными мутациями, которые эффективно «переплетают» сигнальные сети клеток, контролирующие баланс между ростом, дифференцировкой и гибелью клеток [7]. Точно так же многие внутриклеточные патогены, включая бактерии и вирусы, производят специфические белки, которые «переплетают» эндогенные сигнальные пути [7]. 8–10]. Многие белки бактериальных патогенов, которые взаимодействуют с клеточной сигнальной киназой и путями регуляции актина, часто для подавления иммунного ответа хозяина или усиления инфекции (см. Дополнительную вставку 1).Таким образом, используя синтетическую биологию для понимания пластичности путей и того, как их поведение изменяется из-за сетевых возмущений, мы можем получить лучшую основу для понимания стратегий, которые патоген принимает для использования внутренней уязвимости сигнальных сетей. Более того, мы можем разработать стратегии для возврата больной сети к стабильному, непатологическому поведению. Наиболее стабильные методы лечения на основе сети могут включать не просто блокировку первичного онкогенного белка лекарством, а изменение структуры сети таким образом, чтобы она располагалась в новой и стабильной области поведенческого пространства.

Применение инженерной передачи сигналов в терапии и биотехнологии

Еще одним мотивом для разработки сигнального поведения клеток является возможность конструирования клеток, запрограммированных для выполнения точно разработанных приложений (). Представьте себе, если бы мы могли имитировать и превзойти эволюцию, используя набор молекулярных компонентов для генетической инженерии клеток, которые выполняют индивидуально разработанные реакции. По мере развития биологии стволовых клеток [11–12] и развития таких методов, как адоптивная иммунотерапия [13–14], возможность использования клеточной терапии становится все ближе, но это потребует сложной клеточной инженерии для точного контроля поведения клеток.Например, без нового контроля, как может быть направлена ​​правильная миграция и дифференцировка стволовых клеток для регенеративной медицины при отсутствии нормальных сигналов развития? Более того, по мере того, как все больше промышленных производственных процессов задействуют биологические организмы (такие как производство биотоплива или материалов) [15], может появиться возможность разработать более разумные производственные штаммы, которые, как и макроскопические производственные объекты, будут иметь системы клеточного контроля, которые отслеживают внешние и внутренние состояния для оптимизации производство.Это может быть особенно важно, поскольку мы просим ферментирующие организмы, такие как дрожжи, производить широкий спектр материалов, которые могут оказывать токсическое действие.

Разработанные противораковые клетки

Если мы сосредоточимся на разработке индивидуальных терапевтических клеток, которые могут воспринимать сигналы болезни и выполнять целенаправленные и точно откалиброванные терапевтические программы, какое поведение мы хотели бы? Иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты или естественные клетки-киллеры, можно модифицировать для идентификации и уничтожения опухолевых клеток.Такие клетки уже можно удалить у пациентов, генетически модифицировать, размножить ex vivo и адаптивно перенести обратно пациенту [16-17]. Противораковая клетка может быть разработана для обнаружения комбинации сигналов, связанных с опухолью, включая специфические опухолевые антигены, гипоксию, органоспецифические антигены, а также специфические факторы роста и цитокины, которые секретируются опухолями, чтобы избежать нормальных иммунных ответов и создать микроокружение, способствующее развитию опухолей [18],. Инженерные клетки, которые распознают эти факторы, но связаны с противоопухолевым ответом, были бы идеальными.Также критически важно разработать внешний контроль (например, небольшую молекулу) или предохранительные переключатели для этих терапевтических клеток, чтобы их поведение можно было отключить или ослабить в ответ на нежелательные побочные эффекты, или чтобы титровать величину их реакции.

Сконструированные клетки, которые обнаруживают эти специфические для опухоли входные данные, могут быть сконструированы для получения ряда различных ответов, таких как производство агентов визуализации, которые помогают в идентификации опухолей и метастазов, и контроль эндогенных иммунных клеточных реакций, таких как хемотаксис, фагоцитоз и убийство клеток.Возможно, наиболее важно то, что эти терапевтические клетки могут быть запрограммированы на секретирование факторов, нарушающих локальное микроокружение опухоли, таких как провоспалительные цитокины и факторы антиангиогенеза, что делает их непригодными для устойчивого роста опухоли. Это было бы эквивалентно созданию специальной иммунной клетки, которая выводит из строя опухолевые клетки и микроокружение на нескольких уровнях.

Направленная иммуносупрессия

Иммунная клетка также может быть разработана для блокирования аутоиммунного заболевания или отторжения трансплантированных органов.Обычная иммуносупрессивная лекарственная терапия имеет широкие и серьезные системные эффекты. Сконструированная клетка может быть запрограммирована на местную иммуносупрессивную реакцию, возможно, в ответ на специфические аутоиммунные антигены или антигены трансплантата в сочетании с цитокиновыми сигнатурами сильного аутоиммунного ответа. Такие клетки могут быть запрограммированы на хемотаксис к участкам этих сигналов и реагировать путем секреции противовоспалительных цитокинов, которые отключили бы воспалительные петли положительной обратной связи, которые обычно приводили бы к полномасштабной аутоиммунной реакции или реакции отторжения.

Хотя индивидуально разработанные терапевтические клетки — это будущее, полезно подумать о том, какое поведение обнаружения и реакции будет ценным, так как они обеспечивают полезные целевые вехи в разработке инструментов и стратегий для перестройки клеток.

Можно ли проектировать сети передачи сигналов сотовой связи?

Существуют большие разногласия относительно того, действительно ли элементы можно спроектировать. Системы клеточной сигнализации настолько тонко оптимизированы, что наше вмешательство приведет к катастрофическим сбоям, или настолько надежно спроектированы эволюцией, что добавление новых генов и сетевых связей не сможет существенно изменить функцию? Очевидно, что эволюция смогла перестроить клеточные сигнальные пути, чтобы получить разнообразные ответы — на определенном уровне они относительно пластичны и эволюционируют.Таким образом, прежде чем пытаться создать новое клеточное поведение, может быть поучительно подумать о том, как эволюция может достичь инновационных новых функций.

Отличительной чертой сигнальных белков, которая, как полагают, играет важную роль в эволюции, является их модульная структура. Они почти всегда состоят из множества модульных доменов, некоторые из которых выполняют каталитическую функцию, а многие — специфические регуляторные функции или функции взаимодействия [19, 20]. Эти модульные домены встречаются в различных сигнальных белках в самых разных комбинациях.Это привело к модели, согласно которой разнообразие сигнальных функций может развиваться посредством рекомбинации этого набора доменов. Таким образом, в принципе, если бы мы могли понять, как эволюция работает с этими модулями, мы могли бы использовать тот же набор инструментов, чтобы найти области пространства поведения, которые эволюция, насколько нам известно, еще не исследовала.

Почему сигнальные белки и системы настолько модульны? Большинство согласны с тем, что в эволюционной временной шкале организмы находятся под давлением приспособленности к развитию инновационных клеточных сигнальных реакций, которые могут привести к преимуществам в изменяющейся окружающей среде и по сравнению с конкурирующими организмами.Под воздействием такого рода изменяющегося давления приспособленности модульные системы могут спонтанно развиваться как способ облегчить более быструю диверсификацию функций [21]. Алон и его сотрудники смоделировали эволюцию биологической сети, используя эволюционные алгоритмы для поиска простых вычислительных сетей, которые решают поставленную цель [22]. Когда они неоднократно меняют целевую цель, результирующие сети спонтанно развивают более модульные решения — сети, которые имеют внутри себя функциональные подсети. Эти заранее сформированные подсети — модули — могут быть быстро переподключены новыми способами для перехода от одной целевой функции к другой.По сути, кажется, что модули предоставляют способ быстро перемещаться из одного функционального пространства в другое, перепрыгивая через обширные области нефункционального сетевого пространства. Таким образом, модульная организация сигнальных белков и сетей может отражать давление на эти системы с целью создания поведения, которое соответствует потребностям постоянно меняющейся среды.

Важность модульности в облегчении эволюции новых функций согласуется с концепциями эволюции и развития, в которых утверждается, что большая часть диверсификации функций и морфологии организмов эволюционирует через альтернативное регулирование существующих компонентов, а не на изобретение принципиально новых компонентов [23].Хотя многие из этих идей были разработаны с упором в первую очередь на регуляцию генов с помощью различных цис-действующих модулей, они также могут применяться к регуляции ключевых каталитических сигнальных модулей с помощью разнообразных локализационных и регуляторных модулей [24,25]. Неудивительно, что многие из усилий по разработке нового сигнального поведения, описанного ниже, используют стратегии рекомбинации модульных функциональных единиц новыми способами, таким образом, по сути, используя эволюционную стратегию для создания новой функции.

Разработка новых сенсорных систем

Одним из наиболее важных инструментов для изменения поведения клеток будет способность создавать новые датчики и рецепторы для целевых входов.Однако это, пожалуй, наименее охарактеризованный элемент в инженерии клеточной сигнализации, потому что вселенная возможных входов настолько обширна и часто включает проблему работы с относительно сложными мембранно-ассоциированными мембранными белками. Ниже мы описываем недавний прогресс в модификации или конструировании различных рецепторных молекул.

Перенаправление выхода естественных рецепторов

Природные рецепторы, которые обнаруживают специфические эндогенные входы, могут быть спроектированы для генерации неродной выходной реакции.Есть несколько примеров перенаправления нативного рецептора, чтобы вызвать новый транскрипционный ответ. Один из таких подходов использует модульную структуру рецепторного белка Notch. Notch — это трансмембранный рецептор, который обнаруживает белок Delta, присутствующий на соседних клетках, — критический канал межклеточной коммуникации в развитии и дифференцировке. Когда Delta связывает Notch, трансмембранная область Notch расщепляется мембранной протеазой, высвобождая C-концевой домен Notch в цитоплазму.Этот домен может проникать в ядро ​​и активировать транскрипцию гена. Struhl et al. Показали, что этот модуль фактора транскрипции рецептора notch может быть заменен синтетическим фактором транскрипции (Gal4-AD), так что при активации in vivo этот химерный рецептор notch может активировать гены, нацеленные на новый фактор транскрипции [26 , 27]. Хотя эту конструкцию использовали в качестве репортера для активации Notch, ее можно было легко использовать для связывания обнаружения нативного дельта-лиганда с совершенно новым набором ненативных генов-мишеней.

Barnea et al. Расширили эту модульную стратегию, вдохновленную Notch, путем создания новых транскрипционных выходов для других рецепторов, которые обычно не используют этот тип механизма активации протеаз [28]. Когда рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), активируются своими специфическими лигандами, они часто рекрутируют β-аррестин, который участвует в подавлении передачи сигналов GPCR. Barnea et al. Слили аррестин с высокоспецифичной протеазой вируса травления табака (TEV), так что он был совместно задействован в активированных GPCR.Синтетический фактор транскрипции также был слит с цитоплазматическим хвостом GPCR, связанным сайтом расщепления TEV. Таким образом, когда сконструированный слитый белок GPCR активируется своим эндогенным лигандом, он рекрутирует партнера протеазы аррестин-TEV, который расщепляет и высвобождает домен фактора транскрипции из GPCR, посредством чего он может проникать в нуклеазу и активировать гены-мишени. Эта система успешно использовалась для связывания новых репортеров транскрипции с активацией широкого спектра специфических GPCR.Ответ очень специфичен благодаря специфичности расщепления TEV. В принципе, эту стратегию можно использовать для связывания любого эндогенного сигнала, опосредованного GPCR, с экспрессией желаемых генов-мишеней.

Barnea et al. Также использовали эту стратегию для связывания передачи сигналов эндогенной рецепторной тирозинкиназы (RTK) с новыми выходами транскрипции [28]. Большинство RTK при стимуляции активируют свои киназные домены, которые опосредуют аутофосфорилирование цитоплазматических тирозинов для рекрутирования белков, содержащих домен Sh3.Здесь протеаза TEV была слита с рекрутированными доменами Sh3, а синтетический фактор транскрипции был слит с цитоплазматическим хвостом RTK через сайт расщепления протеазой TEV. Итак, активация RTK ведет к рекрутированию слияния Sh3-домен-TEV, высвобождению ассоциированного с рецептором фактора транскрипции и транскрипции гена инженерии. Примечательно, что эта простая модульная стратегия может быть применена к нескольким классам рецепторов, если они привлекают определенный белок-партнер при активации.

Howard et al. Использовали модульность передачи сигналов RTK для перенаправления сигнала онкогенного роста на апоптотический ответ [29]. Они сконструировали новый адаптерный белок Sh3, в котором домен Sh3, распознающий активированный RTK, был слит с доменом эффектора смерти от Fadd. Таким образом, активация RTK привела к рекрутированию в мембрану домена смерти, что вызвало ответ клеточной смерти. Возможность увязки других новых результатов с этими ключевыми событиями найма еще недостаточно изучена.

Рецепторы, которые обнаруживают новые входные данные малых молекул

Вышеупомянутые стратегии сосредоточены на способах получения рецепторов, которые обнаруживают эндогенные сигнальные молекулы, и конструируют их так, чтобы вызывать новые ответы. Однако во многих случаях для клеточной инженерии могут потребоваться рецепторы, которые обнаруживают новые сигналы, для которых нет эндогенных рецепторов. Эти новые сигналы включают в себя небольшие молекулы, которые мы можем захотеть обеспечить внешнее управление инженерной системой.

Относительно хорошие успехи были достигнуты в использовании GPCR в качестве платформы для конструирования контролируемых рецепторов на малых молекулах.Некоторые GPCR, такие как опиоидные рецепторы, могут активироваться их эндогенными лигандами и специфическими низкомолекулярными агонистами. Конклин, Рот и его сотрудники сконструировали молекулы, известные как рецепторы, активируемые исключительно синтетическими лигандами (RASSL) [30,32]. Эти рецепторы мутированы так, что они не могут связывать свой эндогенный лиганд, но активируются и вызывают свой эндогенный нисходящий эффект в ответ на небольшой фармакологически инертный молекулярный агонист.

GPCR различаются по своим выходам, отчасти потому, что отдельные рецепторы связываются со специфическими гетеротримерными G-белками.Дальнейшая разработка дала версии RASSL, которые специфически связаны с каждым из этих отдельных нисходящих путей, тем самым позволяя малым молекулам контролировать очень разнообразный набор выходов. Эти RASSL были успешно применены у трансгенных мышей — по сути, перестраивая передачу сигналов в полноценном живом организме — в основном в качестве диагностического и аналитического инструмента. Применение было разнообразным, учитывая широкое использование GPCR в разных тканях. Например, мыши, несущие вкусовые нейроны, экспрессирующие RASSL, проявляли специфические сладкие (привлекательные) или горькие (аверсивные) ответы на воду, смешанную с агонистом (спирадолином), в зависимости от того, в каком типе нейрона они экспрессировались [33].Кроме того, экспрессия RASSL в клетках сердца позволяет контролировать частоту сердечных сокращений путем введения спирадолина [34]. То, что эти рецепторы in vivo так надежно работают, , намекает на их потенциальную полезность в более сложной клеточной инженерии.

Химические димеризаторы образуют другую стратегию достижения контроля малых молекул над передачей сигналов. Такие стратегии были рассмотрены в другом месте [35,36] и не будут здесь обсуждаться.

Рецепторы, которые обнаруживают определенные пользователем антигены

Было бы идеально разработать рецепторы, которые могут воспринимать ассоциированные с заболеванием антигены, такие как белок, сильно экспрессирующийся в опухоли или инфекционном агенте.Если бы рецепторы могли быть сконструированы для достижения такого же разнообразия и избирательности распознавания, что и антитела, можно было бы обнаруживать широкий спектр входных сигналов и связывать их с конкретными ответами. Химерные антигенные рецепторы (CAR) — рецепторы, созданные с использованием одноцепочечных антител (scFv) как часть механизма их обнаружения, — были разработаны как универсальный каркас этого типа. Эта стратегия проистекает из модульности рецепторов иммунных клеток, таких как рецептор Т-клеток. Хотя Т-клеточный рецептор представляет собой сложный мультибелковый комплекс, сшивания цитоплазматической области субъединицы дзета-цепи CD3 достаточно для индукции передачи сигналов Т-клетками [37].Дзета-цепь CD3 содержит мотивы, которые фосфорилируются при активации тирозинкиназами, такими как Lck, для индукции рекрутирования белков, содержащих домен Sh3, таких как киназа ZAP-70. Слияние цитоплазматической области дзета-цепи CD3 с внеклеточным одноцепочечным антителом (scFv) дает рецептор, часто называемый «Т-тельцем», который при экспрессии в Т-клетках приводит к целенаправленному уничтожению клеток, экспрессирующих узнаваемый антиген (предположительно, поверхностные антигены сшивают и активируют химерные рецепторы) [38,39].Слияние scFv с внутриклеточной областью рецептора Fc (гамма-цепь) может дать химерный антиген-чувствительный рецептор аналогичного типа. Эти исследования подчеркивают модульность этих рецепторов: соединение нового внеклеточного распознающего элемента с нижележащими внутриклеточными сигнальными элементами приводит к новому датчику ввода / вывода.

Эти CAR первого поколения относительно примитивны и дали неоднозначные результаты. Т-клетки, экспрессирующие CAR, направленные против опухолевых антигенов, обладают умеренной сигнальной способностью по сравнению с эндогенными ответами TCR, умеренно пролиферируют ex vivo и in vivo и имеют низкую выживаемость при многократном воздействии антигена [16,17]].Улучшения в этом поведении были сделаны путем включения дополнительных модульных доменов во внутриклеточные области CARs, включая домены от молекул корецепторов, которые являются частью нормальной активации TCR, таким образом, возможно, имитируя более полную активированную внутриклеточную сборку [40,41]. Клетки, содержащие CAR следующего поколения, более эффективно контролируют опухоли ксенотрансплантата у мышей, и в настоящее время переносятся на клинические испытания [16]. Более сложная инженерия CAR может привести к еще большему улучшению терапевтической функции.

Датчики, которые обнаруживают физические сигналы, такие как свет

Еще одна интересная область исследований — разработка генетически закодированных датчиков, которые могут обнаруживать свет и преобразовывать его в конкретный биологический ответ, область, называемая оптогенетикой. Встречающиеся в природе светочувствительные белки растений, водорослей и бактерий можно модифицировать для использования в высших организмах, включая млекопитающих. Эти инструменты чрезвычайно полезны в качестве пространственно-временных шкал для контроля и анализа сложного клеточного и организменного поведения, особенно когда они экспрессируются с помощью промоторов, специфичных для клеточного типа.В долгосрочной перспективе оптогенетические инструменты могут использоваться для удаленного контроля клеток, используемых в терапевтических целях, хотя существуют серьезные технические проблемы, такие как то, как свет может доставляться в организм, которые необходимо будет преодолеть. Наиболее часто используемые сегодня оптогенетические инструменты — это белки микробного канала родопсин и галородопсин, которые широко используются для контроля функции нейронов. Они рассмотрены в другом месте [42] и не будут здесь подробно обсуждаться.

Совсем недавно появились дополнительные оптогенетические инструменты, которые могут быть применены к более широкому спектру клеточных сигнальных систем.Airan et al. Сконструировали набор активируемых светом GPCRs, которые могут связываться как с нижележащими Gs, так и с гетеротримерными G-белками Gq [43]. Были созданы химеры светочувствительной зрительной системы GPCR, родопсин (бычий), которые содержат внутриклеточные петли от Gq- и Gs-сопряженных адренергических рецепторов. Эндогенная молекула сетчатки — это светочувствительный хромофор. Эти новые инструменты значительно расширяют «словарь» передачи сигналов, которым можно управлять с помощью света, учитывая важность путей передачи сигналов Gq и Gs в различных типах клеток.

Еще более обобщенная стратегия управления светом включает использование контролируемых светом белковых взаимодействий. Временное взаимодействие конкретных белков-партнеров является основой многих внутриклеточных сигнальных событий (см. Ниже), и рецепторы могут быть обойдены, так что свет напрямую контролирует такие внутриклеточные взаимодействия. Левская и др. Использовали систему взаимодействия фитохрома, полученную из растений — связывание этого фоторецептора с его партнерским доменом PIF может включаться и выключаться с помощью определенных длин волн света — для рекрутирования определенных белков на мембрану точным пространственно-временным образом [44].В случае факторов обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), которые контролируют GTPases семейства Rho, это может быть использовано для запуска активации GTPase и последующих изменений цитоскелета, приводящих к световодному выпячиванию клеток. Хотя этот метод является мощным и потенциально применимым ко многим сигнальным взаимодействиям, система Phy-PIF требует добавления проницаемого для клетки хромофора, который не является эндогенным для клеток млекопитающих. Wu et al. Использовали светочувствительный домен LOV (свет-кислород-напряжение) (обнаруженный в растениях, водорослях и бактериях) для конформационной закупорки Rac GTPase контролируемым светом способом [45].Этот связывающий флавин домен обеспечивает еще один потенциально общий конформационный элемент управления светом, который может быть связан для управления различными сигнальными белками.

Инженерные системы обработки сигналов

В конечном итоге клетки решают, какие программы ответа выполнять на основе внутриклеточных сигнальных сетей, которые принимают и обрабатывают сигналы от сенсорных молекул (см. Выше). Недавняя работа в области сотовой инженерии была сосредоточена на понимании того, как эти сети функционируют для принятия решений и как их можно изменить.

Модульная логика обработки сигналов

Внутриклеточные сигнальные белки имеют высокую модульность (см. Выше). Большинство модулей делятся на два класса (). Первый класс — это ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, которые катализируют посттрансляционные модификации или конформационные изменения, с помощью которых сохраняется информация. В большинстве случаев эти каталитические домены входят в пары: ферменты-писатели (например, киназы) производят модификацию, а ферменты-стиратели (например, фосфатазы) удаляют модификацию.Второй класс — это регуляторные домены или домены взаимодействия, которые модулируют активность каталитических доменов или нацеливают их на конкретных партнеров или сайты в клетке. Эти модули могут опосредовать специфические белок-белковые взаимодействия (либо конститутивные взаимодействия, либо те, которые зависят от посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование) или белок-мембранные взаимодействия. Таким образом, именно регуляторные домены и домены взаимодействия определяют, когда и где активируются каталитические домены и каким партнерам они передают информацию [5].

a | ферментных и регуляторных доменов . Модульные сигнальные белки эукариот обычно состоят из ферментативных доменов и доменов локализации. Ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, а также GEF и GAP, катализируют регуляторные модификации, такие как фосфорилирование и активация GTPase, соответственно (ферментные домены часто входят в пары «писатель» и «стиратель», которые имеют противоположные активности).Эти ферментные домены регулируются и нацелены на домены взаимодействия, включая домены межбелкового взаимодействия, домены мембранного взаимодействия или трансмембранные домены.

b | различных классов многодоменных архитектур . Ферментативные домены могут быть непосредственно нацелены на определенные субстраты, партнеров или субклеточные участки посредством доменов взаимодействия. В качестве альтернативы они могут быть косвенно нацелены через адаптеры или белки каркаса, которые содержат несколько доменов взаимодействия.Домены взаимодействия могут также аллостерически регулировать каталитические домены, участвуя во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях. Такие переключающие белки могут быть активированы конкурирующими лигандами, которые снимают аутоингибирование.

Эти разные классы модулей обнаруживаются в различных комбинациях и расположениях в сигнальных белках (). Каталитические домены, слитые с нацеливающими доменами, могут быть задействованы в определенных комплексах или участках мембраны, где они будут модифицировать определенные мишени; часто эти каталитические домены имеют высокую внутреннюю константу Михаэлиса (Km’s и, следовательно, требуют нацеливания с помощью дополнительных доменов взаимодействия для эффективного катализа.Иногда эти нацеленные взаимодействия регулируются, если, например, взаимодействие зависит от посттрансляционной модификации, такой как нацеливание белков домена Sh3 на аутофосфорилированные сайты pTyr на активированных RTK. Белки с двумя доменами взаимодействия могут действовать как адаптеры, которые переводят одно взаимодействие во второе, что приводит к увеличению гибкости ответа в зависимости от адаптерных белков, которые экспрессируются в конкретном типе клеток. Белки с множественными доменами взаимодействия могут также функционировать как скаффолдные белки, которые организуют несколько белков на пути в комплекс.Эти взаимодействия могут быть конститутивными или предопределенными, или индуцированными такими факторами, как фосфорилирование или конформационные изменения, которые открывают сайты взаимодействия. Таким образом, каркасные белки могут в принципе определять проводные связи сигнальных белков, а также контролировать, когда и где происходит передача сигналов [24, 20].

Вторая важная роль взаимодействия и регуляторных доменов — это непосредственный контроль активности каталитических доменов. Во многих случаях домены взаимодействия участвуют во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях, которые стерически закрывают каталитический домен или конформационно возмущают его — тип регуляции, называемый модульной аллостерией [46].Связывание конкурирующих межмолекулярных лигандов с доменами взаимодействия индуцирует каталитическую активность белков. Часто множественные домены взаимодействия участвуют в автоингибировании каталитического домена кооперативным или иерархическим образом [47, 48]. Эти белки могут функционировать как сложные переключатели с множеством входов, которые требуют определенной комбинации входов для правильной активации. Кроме того, поскольку внешние лиганды активируют эти белки, локализация (управляемая этими взаимодействиями) может быть напрямую связана с активацией.

Разработка новых белковых переключателей

Лим и его сотрудники исследовали, можно ли использовать модульную аллостерическую логику многих природных эукариотических сигнальных белков для создания новых сигнальных переключателей путем рекомбинации доменов (). В самом деле, каталитические домены актинового регуляторного белка N-WASP и GEF семейства Rho могут быть связаны с новыми аутоингибиторными доменами с образованием белков, активность которых регулируется новыми лигандами [49,50]. Внутримолекулярное связывание любого из этих каталитических доменов с доменом PDZ и пептидом лиганда PDZ может давать переключатель, который активируется конкурирующим пептидом PDZ.Точно так же можно добавить несколько доменов взаимодействия, чтобы получить комбинаторный переключатель, отображающий управление логическим элементом И. В зависимости от точной конфигурации доменов и внутримолекулярных взаимодействий типы регуляции могут быть разными в ответ на разные конкурирующие внешние лиганды — один лиганд может активировать белок, а другой репрессировать его. Эти типы разнообразных взаимоотношений между регуляторными доменами напоминают разнообразное поведение, наблюдаемое в природных сигнальных белках, подтверждая представление о том, что этот вид архитектуры переключения облегчает эволюцию разнообразных комбинаторных регуляторных переключателей [48].Dueber et al. Также показали, что синтетические аутоингибирующие переключатели, использующие поливалентные взаимодействия одного и того же типа, приводят к переключениям, поведение активации которых может быть настроено кооперативно от линейного до цифрового ответа [51].

a | инженерных переключателей аллостерических белков . Dueber et al [49,51] показали, что аллостерическая регуляция сигнального белка N-WASP может быть перепрограммирована путем рекомбинации каталитического домена из N-WASP с различными комбинациями доменов взаимодействия.Новые модели поведения включали управление с множеством входов (логический элемент И) и активную активацию, подобную переключателю.

b | с использованием белков каркаса в качестве молекулярной печатной платы для преобразования выходных сигналов . Связь входа / выхода киназного пути MAP в дрожжах может быть перенаправлена ​​через сконструированный химерный каркас, который собирает новую комбинацию киназ [58]. Новые сайты взаимодействия также могут быть добавлены к каркасам для привлечения дополнительных модулирующих факторов.Эти дополнительные факторы могут быть построены синтетическими петлями обратной связи, которые могут быть использованы для создания путей, которые отображают разнообразную динамику передачи сигналов [62].

Каркасные белки как молекулярные схемы

Цепи внутриклеточной передачи сигналов также можно напрямую контролировать, используя регуляторные взаимодействия для перепрограммирования соединений путей. Например, каталитический домен киназы семейства Src, Hck, который обычно регулируется доменами Sh3 и Sh4, может быть слит с доменом PDZ и направлен in vivo для специфического фосфорилирования субстратов с мотивом лиганда PDZ [52].

Белки каркаса также могут быть использованы для создания новых взаимосвязей между входом и выходом пути. У дрожжей существует множество функционально различных киназных путей митоген-активированного протеина (MAP), которые регулируют ответы на феромон спаривания и осмотический стресс [53,54]. Эти пути имеют общие компоненты киназ, но остаются специфическими, потому что каждый путь организован отдельным каркасным белком [55–57]. Химерный каркасный белок, который организует избранных членов путей спаривания и осмотического стресса, дает неприродный путь, в котором феромон спаривания специфически индуцирует программу реакции осмостресса в vivo [58].Подобные ковалентные слияния, которые, подобно каркасу, вызывают взаимодействие между двумя сигнальными белками, могут быть использованы для принудительной передачи сигнала по единственному пути [59].

Совсем недавно было показано, что каркасные белки не только опосредуют линейные отношения ввода / вывода путей, но также координируют набор модуляторных факторов, которые формируют дозовую зависимость и динамику ответа пути [60,61]. Вдохновленный этими природными примерами, Башор и др. Показали, что дрожжевой скаффолд MAP-киназы, белок Ste5, можно использовать в качестве молекулярной печатной платы, чтобы гибко изменять количественное поведение реакции спаривания [62].Слияние дополнительного сайта синтетического взаимодействия с каркасом Ste5 (с использованием пары гетеродимеров лейциновой застежки) способствует привлечению новых модулирующих факторов, таких как фосфатаза MAPK, которая подавляет ответ пути. Однако, если экспрессия и рекрутирование фосфатазы связаны с выходным сигналом пути, возникает петля отрицательной обратной связи, которая приводит к адаптации — временный ответ, за которым следует автоматический возврат к более низким уровням выхода, что является ключевым поведением во многих биологических сенсорных системах.Связывая по-разному положительные и отрицательные модуляторы пути, этот небольшой набор элементов управления каркасом может быть использован для генерации очень разнообразных дозовых реакций и динамического поведения, включая высоко кооперативное переключение, отложенные ответы, ускоренные ответы и генерацию импульсов. Эти исследования показывают, как организующие центры, такие как каркас, являются богатой платформой для обработки и формирования внутриклеточной передачи сигналов посредством эволюции или инженерии.

Инженерная пространственная самоорганизация

Один из наиболее плохо изученных аспектов передачи сигналов в клетке — это то, как контуры, состоящие из диффундирующих молекул, могут приводить к высокоточной пространственной организации в клетке, такой как направленная поляризация и миграция.Этот тип самоорганизации является аспектом схемы управления, где нет хороших электронных или инженерных аналогов, и где биология может обучать инженерии.

Инженерные принципы применяются для понимания механизма поляризации почкующихся дрожжей, S. cerevisae . Поляризация контролируется GTPase Cdc42, которая в конечном итоге локализуется в одном сайте материнской клетки, приводя к образованию единственной почки, которая врастает в дочернюю клетку [63].Примечательно, что этот процесс приводит к образованию единственной бутоны почти со 100% надежностью. Цепь положительной обратной связи с участием Cdc42 GTPase является ключевой в поляризации: активный Cdc42 на мембране рекрутирует цитоплазматический белок GEF Bem1, который активирует и локализует дополнительный Cdc42 [64]. Хотя этот вид петли обратной связи ведет к образованию фокусов Cdc42, быстрая диффузия и перераспределение Bem1 между конкурирующими фокусами может быть важным, чтобы позволить одному из фокусов стать доминирующим, что ведет к сингулярности почкования.Эффект замедления диффузии и перераспределения Bem1 за счет связывания его с трансмембранным мотивом был проанализирован [65]. Bem1, привязанный к мембране, может спасти летальность от нокаута Bem1, но не может подвергаться диффузии в цитоплазме. Вместо этого он доставлялся к плазматической мембране в везикулах через актиновые кабели (также координируемые фокусами Cdc42) и от мембранных фокусов посредством эндоцитоза и, таким образом, перераспределялся намного медленнее. Наблюдались серьезные дефекты сингулярности, такие как множество устойчивых конкурирующих фокусов Cdc42, и частота многопочкованных клеток увеличивалась до ~ 5%.Подобные исследования помогают выявить требования к точно контролируемой пространственной самоорганизации и предполагают, что мы можем научиться создавать сигнальные цепи, которые производят индивидуальные пространственные результаты с важным терапевтическим поведением (например, регенеративная медицина, которая требует определенной клеточной морфологии и ориентации).

Создание предсказуемой инженерии передачи сигналов

Исследования, приведенные выше, показывают, что сигнальные системы являются высокомодульными и пластичными и рекомбинирующие модули, особенно каталитические домены с новыми регуляторными доменами, могут приводить к отличному ответному поведению.Таким образом, вопрос уже не в том, можно ли спроектировать сигнальные системы для получения нового поведения, а в том, можно ли их спроектировать таким образом, чтобы мы могли предсказать, какое поведение проявится и насколько успешной будет каждая спроектированная схема.

Проблема непредвиденных перекрестных помех

Одна из основных проблем, связанных с передачей сигналов инженерной клетки, заключается в том, что естественные компоненты — инструментарий доступных доменов — повторно используются, что может привести к непредвиденным перекрестным помехам. Приведут ли инженерные взаимодействия, которые вы создаете, к специфическому фосфорилированию желаемого белка, или используемый домен также будет перекрестно взаимодействовать с другими мишенями, конкурентно титруя важные физиологические взаимодействия и приводя к непредвиденным эффектам или сбоям в спроектированной схеме? Часто природные части не обладают абсолютной специфичностью, и эволюция, скорее всего, использует сложные сети перекрестной реактивности, чтобы обеспечить важную скоординированную регуляцию.Хотя такая сложная система, похожая на нейронную сеть, может обеспечить преимущества для клетки, это проклятие для прогнозной инженерии.

Представляя будущий инструментарий сигнализации

Одним из решений этой проблемы является сборка инструментария из деталей, специально оптимизированных для проектирования. Этот вопрос важен для любого типа сигнальной части, но мы сосредоточимся на том, как собрать полезный инструментарий из частей, взаимодействующих с белками ().

Нативная клетка имеет свой собственный репетитор модулей взаимодействия с белками, и поэтому сложно разработать новые функции с использованием связанных модулей взаимодействия, которые могут показывать непреднамеренные и непреднамеренные перекрестные помехи в камере.Оптимизированный набор взаимодействующих частей может значительно повысить предсказуемость клеточной инженерии, исключив возможность непреднамеренных перекрестных помех. Несколько стратегий оптимизации включают разработку модулей взаимодействия, которые используют неиспользованную специфичность; разработка составных, многодоменных взаимодействий; объединение модулей взаимодействия с новым субклеточным нацеливанием; и импорт модулей ортогонального взаимодействия (либо созданных синтетически, либо из других организмов), которых нет в клетке-хозяине.

Хотя природа неоднократно использовала семейства частей, такие как домены взаимодействия определенного типа, недавние исследования показывают, что в некоторых случаях члены семейства содержат неиспользуемые сайты узнавания внутри этих доменов. Их можно использовать для создания пар домен-пептид, которые одновременно оптимизированы для взаимодействия со своим правильным партнером, избегая при этом перекрестного взаимодействия с другими членами семейства [66,67]. Фактически были сконструированы пары PDZ-домен-лиганд и гетеродимеризующиеся пары лейциновой застежки-молнии, которые оптимизированы, чтобы избежать перекрестной реакции с естественными доменами того же типа [68,69].Избирательность и предсказуемость существующих доменов взаимодействия также можно улучшить путем разработки составных взаимодействий. Конечно, многодоменное сотрудничество — естественный механизм повышения специфичности. Но новый поворот в этом вопросе — это разработка составных двухкомпонентных взаимодействий типа «раскладушка». Koide et al. Взяли домен PDZ и слили его с доменом фибронектина [70]. Используя фаговый дисплей, они отобрали варианты этого тандемного домена, которые связывают определенный пептид, так что он находится между двумя доменами.Резко увеличенная площадь распознавания приводит к взаимодействиям с гораздо более высокой специфичностью и сродством. Другое решение для специфичности, которое наблюдается в природе, — это дифференциальная компартментализация. Если нацеливающие мотивы могут быть использованы для локализации партнерских белков в определенных органеллах или клеточных участках, то мотивы взаимодействия, вероятно, будут функционировать более специфическим образом, особенно если в этом месте или органелле происходит мало или совсем не происходит конкурирующих взаимодействий этого типа.

Альтернативный подход к достижению надежной специфичности заключается в импорте доменов из других организмов, которых нет в создаваемом хозяине. Напр., PDZ домены могут быть импортированы в дрожжи (у которых отсутствует большинство таких доменов), хотя возможность случайных перекрестных реагирующих партнеров не может быть исключена [58]. Примером ортогональной молекулярной системы, которая была успешно перенесена на нового хозяина, является бактериальная рекомбиназная система Cre-Lox, которая надежно используется для создания сложных хромосомных перестроек в сложных организмах, включая мышей [71].

Таким образом, представляя инструментарий будущего, можно захотеть создать набор из десяти или около того пар взаимодействия белков, оптимизированных для конкретного выбранного организма (например, E.coli , S.cerevisae , млекопитающие) в том, что они ортогональны, то есть известно, что они не реагируют перекрестно с протеомом хозяина или белками в наборе инструментов, за исключением их родственного лиганда. Также важно, чтобы эти взаимодействия были настраиваемыми, поэтому серия лигандов для каждого домена взаимодействия, которые различаются по аффинности на несколько порядков, были бы идеальными.Это позволило бы систематически исследовать, как сродство вербовки меняет поведение системы.

Комбинаторный дизайн и прогнозирование

Другой другой, но все же дополнительный подход к предсказуемому проектированию передачи сигналов соты состоит в использовании комбинаторной изменчивости. В ходе естественной эволюции рекомбинация сигнальных модулей для генерации новой функции, по-видимому, не была спроектирована или направлена, а скорее была относительно случайной, и именно естественный отбор выявил события перепрограммирования, которые привели к преимуществам приспособленности.Таким образом, очень плодотворным подходом, учитывая отсутствие предсказуемости в клеточной инженерии, могло бы быть построение комбинаторных библиотек синтетических схем и выбор желаемой функции [25,72]. Более того, этот подход можно было бы комбинировать с полу- прогнозное проектирование, при котором могут быть разработаны общие архитектуры спроектированных схем, но комбинаторные методы используются для поиска в более широком диапазоне пространства параметров (с использованием вариантов каждого модуля в библиотеке). Сосредоточение внимания на комбинаторном выборе может также обеспечить очень полезную стратегию на заре синтетической биологии, поскольку это может помочь нам быстрее узнать о основных принципах проектирования.

Outlook

Цель понимания того, как клетки общаются и принимают решения, остается очень привлекательной, особенно потому, что понимание молекулярного языка внутри клетки может позволить нам общаться с клетками и инструктировать их выполнять новые запрограммированные функции. Наша способность перестраивать клеточную сигнализацию может обеспечить множество мощных приложений, таких как терапевтические клетки, запрограммированные на обнаружение селективного набора сигналов, связанных с заболеванием, и на локальный ответ точно настроенным образом.

Хотя эволюция достигла такого рода инноваций и точной инженерии клеточных функций, мы только начинаем понимать, как достичь такого рода цели. У нас есть хорошее фундаментальное понимание логики клеточных сигнальных механизмов и источников функциональной пластичности. Кроме того, были сделаны первые важные шаги в разработке новых рецепторно-сенсорных систем, а также новых или модифицированных схем обработки внутриклеточных сигналов. Несмотря на эти инструменты, на сегодняшний день было приложено очень мало усилий для того, чтобы связать эти типы компонентов новыми способами, чтобы получить более крупные интегральные схемы, способные давать очень точные и точные отклики.Такие усилия продолжаются. Например, Cell Propulsion Lab — это наномедицинский центр Национального института здравоохранения (http://nihroadmap.nih.gov/nanomedicine/devcenters/cellularcontrol.asp), который пытается использовать относительно простые противоопухолевые иммунные клетки, созданные с использованием синтетических рецепторов химерных антигенов ( CAR), и улучшают обработку их сигналов и набор ответов, которые они вызывают, чтобы оптимизировать клетки для экспансии ex vivo, , in vivo, выживания, противоопухолевой цитотоксичности и нарушения благоприятного микроокружения опухоли.Будет интересно увидеть, как будут развиваться эти типы усилий и как эти проблемы повысят сложность и надежность сотовой инженерии.

a | перенаправление собственных входов на новые выходы . С-концевой домен рецептора notch представляет собой фактор транскрипции, который высвобождается в результате трансмембранного протеолиза при активации лигандом дельта. Замена альтернативным доменом фактора транскрипции дает новый ответ экспрессии гена [26].Выход рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), может быть перенаправлен аналогичным образом путем слияния домена фактора транскрипции через привязку с сайтом протеазы TEV. Активация GPCR приводит к привлечению белка аррестина. Если в клетке экспрессируется слияние протеазы аррестин-TEV, активация GPCR приводит к высвобождению фактора транскрипции и новому выходу экспрессии гена [28]. Таким образом, активация GPCR может быть произвольно связана с новым транскрипционным выходом. Выход рецепторной тирозинкиназы (RTK) может быть перенаправлен за счет привлечения синтетических адаптеров домена Sh3 или PTB к активированному и фосфорилированному тирозин рецептору.Домен Sh3 может быть использован для рекрутирования протеазы TEV (чтобы снова высвободить искусственно связанный транскрипционный домен) [28] или для рекрутирования новых эффекторных доменов, таких как те, которые участвуют в гибели клеток [29].

b | инженерный новаторский контроль ввода для собственных ответов . GPCR были сконструированы так, чтобы их контролировали низкомолекулярные агонисты путем мутации их внеклеточной поверхности, так что они больше не связывают свои эндогенные лиганды (рецепторы, активируемые исключительно синтетическим лигандом — RASSL [32]).Рецепторы, которые активируют Т-клетки в ответ на произвольные входные данные, могут быть созданы путем слияния сконструированных одноцепочечных антител (scFv) с внутриклеточной областью Т-клеточного рецептора (дзета-цепь CD3), которые называются рецепторами химерных антигенов (CARs [16, 17]). Событие передачи сигнала, опосредованное рекрутингом, может быть помещено под световой контроль путем замены эндогенного взаимодействия на светозащитное взаимодействие, пара взаимодействий Phytochrome-PIF от растений [44].

a | Цепь поляризации дикого типа контролирует образование одиночных почек. В почкующихся дрожжах локализованная активация полярности GTPase Cdc42 усиливается петлей положительной обратной связи — активный Cdc42 рекрутирует каркасный белок Bem1, совместно собирает активированную p21 киназу (PAK — Ste20) и Cdc42 GEF (Cdc24). Хотя клетка может иметь несколько фокусов Cdc42, они быстро распадаются на один доминантный фокус, который развивается только в клетки. Предполагается, что быстрая скорость обмена диффундирующим комплексом Bem1 / PAK / GEF между конкурирующими фокусами Cdc42 является критической для разделения в один доминантный фокус.

b | синтетическая цепь медленной поляризации приводит к образованию множественных бутонов . Чтобы проверить эту гипотезу, Bem1 был искусственно привязан к мембране через слитый мотив нацеливания на мембрану [65]. Хотя этот связанный с мембраной Bem1 может должным образом собирать комплекс Bem1 / PAK / GEF на участках активности Cdc42 (т.е. петле положительной обратной связи), обмен комплексом между конкурирующими фокусами Cdc42 происходит медленно (зависит от везикулярного транспорта через актиновые кабели и эндоцитоза) .Эта синтетическая поляризационная схема, следовательно, приводит к плохому разрешению конкурирующих фокусов Cdc42 и гораздо более высокой частоте (5% против ~ 0%) многопучковых клеток (микрофотографии из [65]).

Ссылки

Разработка индивидуальных сигнальных цепей клеток

Nat Rev Mol Cell Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 8 ноября.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC2975372

NIHMSID: NIHMS246517

Wendell A.Lim

HHMI и отдел клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF, The Cell Propulsion Lab, NIH Nanomedicine Development Center, NSF Synthetic Biology Engineering Research Center

Венделл А. Лим, HHMI и отдел клеточной и молекулярной фармакологии, UCSF , Лаборатория движения клеток, Центр разработки наномедицины NIH, Исследовательский центр синтетической биологии NSF;

Abstract

Живые клетки развили широкий спектр сложных сигнальных реакций, которые позволяют им выживать в различных условиях окружающей среды и выполнять определенные физиологические функции.Наше все более сложное понимание молекулярных механизмов клеточных сигнальных сетей у эукариот выявило удивительно модульную организацию, и синтетические биологи изучают, как это можно использовать для создания клеток с новым сигнальным поведением. Этот подход начинает раскрывать логику того, как клетки могут развивать инновационные новые функции, и подталкивает нас к захватывающей возможности создания пользовательских клеток с точными функциями восприятия и реакции, которые могут быть полезны в медицине и биотехнологии.

Ключевые слова: передача сигналов клеток, инженерия, синтетическая биология, терапевтический, MAP-киназа, каркас, модули, белковые взаимодействия, N-WASP, рецепторы, GPCR, Notch, RTK, рак, адоптивная иммунотерапия, химерные антигенные рецепторы, Т-клетки. , оптический контроль, биопродукция

Живые клетки — это высокодинамичные системы, которые используют сложные молекулярные сигнальные цепи для мониторинга внешнего и внутреннего состояния и выполнения соответствующих физиологических реакций. Как и любая сенсорная машина, созданная или созданная человеком, эти клеточные сигнальные цепи содержат подсистемы принятия решений, которые действуют как сенсоры и процессоры (например, рецепторы и их последующие эффекторы), которые в конечном итоге контролируют различные подсистемы ответа (такие как транскрипция генов и динамика цитоскелета) ( ).Основная цель современной клеточной биологии — понять, как эти молекулярные сигнальные системы достигают своих сложных ответов, которые оптимально настроены для их физиологической роли. Хотя подавляющее большинство исследований нацелено на анализ, картирование и анализ сигнальных сетей клеток, наше растущее понимание того, как работают эти системы, привело к появлению радикально нового подхода — усилий по разработке и созданию собственных синтетических сигнальных цепей [1,2 ].

a | Клетки обычно воспринимают стимулы окружающей среды через рецепторы и другие датчики .Затем эта информация обрабатывается внутриклеточными сигнальными сетями, которые, в свою очередь, задействуют различные клеточные продукты, включая экспрессию генов, секрецию, изменения цитоскелета и рост клеток.

b | Некоторые из основных проблем в развитии или разработке новых сигнальных цепей: : достижение правильной связи определенных входов и конкретных выходов; настройка количественного поведения сигнального ответа — доза-реакция и динамика — так, чтобы они были оптимальными для физиологической функции; и создание устойчивых пространственно самоорганизующихся процессов, таких как процессы, связанные с поляризацией клеток, направленной подвижностью, делением клеток и компартментализацией клеток.

Здесь мы сосредоточимся на синтетической биологии передачи сигналов и посмотрим, как можно спроектировать сигнальные схемы эукариотических клеток для создания клеток с заданным поведением передачи сигналов. Эукариотические клетки используют сети сигнальных белков, чтобы ощущать окружающую их среду и обеспечивать быстрые ответы. Поскольку сети обработки сигналов в клетках функционируют в трехмерном пространстве, они также контролируют сложные пространственные или морфологические клеточные реакции. Мы рассмотрим, как могут быть созданы сигнальные цепи с точным поведением реакции, учитывая, как определяется специфичность ответа (то есть, какие наборы выходных сигналов связаны с конкретным входом), как точно настроенная доза-реакция или временная динамика профили ответов оптимизированы для конкретных физиологических функций и того, как можно достичь сложного пространственного и морфологического контроля ().Мы также рассмотрим, почему появились усилия по разработке и созданию специализированных синтетических сигнальных цепей, как они могут обеспечить более глубокое видение принципов и механизмов разработки молекулярных сигнальных систем и как индивидуализированные реакции на поведение могут быть применены в медицине и биотехнологии. Наконец, мы рассматриваем, как в будущем могут быть разработаны инструменты и методы, которые упростят разработку клеточного поведения.

Почему инженерная сигнализация ячейки?

Прежде чем рассматривать конкретные примеры сконструированных сигнальных путей, полезно обсудить мотивацию инженерии клеточной сигнализации.Попытка создать новое сигнальное поведение в клетках может показаться смелой и глупой целью, учитывая, что у нас еще нет полного или надежного предсказательного понимания естественных сигнальных цепей клеток. Однако разработка клеточной сигнализации — это не просто процесс применения уже хорошо разработанного понимания, но она предлагает подход к «пониманию через построение». В то время как биология традиционно была наукой анализа и деконструкции для выявления генов и молекул, которые важны для конкретного процесса, синтетическая биология предлагает обратный подход, фокусируясь на том, как отдельные молекулярные части могут быть собраны в системы, которые выполняют сложное поведение.Поскольку в настоящее время у нас есть полностью секвенированные геномы и огромное количество протеомных данных, нам не хватает не полного списка молекулярных частей, а скорее понимания того, как эти части сочетаются друг с другом функционально согласованным образом. Разработка новых сигнальных сетей клеток предлагает нам подход к тестированию и расширению нашего понимания принципов организации сложных молекулярных систем.

В этом смысле синтетическая биология передачи сигналов не просто ориентирована на достижение цели приложения, такой как построение клетки с целевой функцией, но также является исследовательской наукой, в которой важно понимать, какие конструкции «работают». и как они соотносятся с «неработающими» дизайнами.Если, например, у кого-то есть естественная сигнальная сеть, которая выполняет сложное представляющее интерес поведение, традиционная генетическая деконструкция может использоваться для идентификации молекул и связей, которые необходимы и важны для функции (). Однако затем можно использовать синтетические подходы для систематического изучения многих типов изменений — альтернативных сетевых связей, настройки силы связей, добавления новых связей — для проверки того, какие сети совместимы с этим интересующим поведением. Анализируя естественную сеть или проектируя единственную успешную схему, вряд ли можно получить более глубокое понимание функционального ландшафта, которое может дать более полное и систематическое исследование синтетической схемы () [3–5].В этом смысле попытки спроектировать клеточное поведение сродни ранней истории синтетической органической химии, где синтез новых или модифицированных молекул обеспечил дополнительный подход к химическому анализу в развитии фундаментальных теорий химической связи, структуры и реакционной способности [ 6]

и | понимание принципов дизайна. Традиционно для анализа сигнальной сети используются такие методы, как нарушение гена.Синтетические подходы предлагают дополнительную информацию, создавая альтернативные версии сети, которые различаются как подключением к сети, так и мощностью каналов. Сопоставляя пространство функциональных (красные кружки) и нефункциональных (синие кружки) вариантов, можно получить более глубокое понимание функциональных требований.

b | конструирует дизайнерские сигнальные пути для терапевтических или биотехнологических приложений. Мы надеемся собрать набор сигнальных модулей, которые можно использовать для создания ячеек со спроектированными сигнальными ответами.Противораковая клетка может обнаруживать комбинацию сигналов опухоли и давать такие ответы, как выработка реагентов для визуализации, уничтожение клеток или секреция факторов, нарушающих микросреду опухоли. Такая ячейка может также иметь предохранительные выключатели, которые могли бы отключить ячейку при необходимости. Иммуносупрессивная клетка может обнаруживать комбинацию аутоиммунного ответа или сигналов отторжения трансплантата и запускать локальные контрмеры, такие как секреция противовоспалительных цитокинов. Интеллектуальная биопродуктивная (ферментационная) клетка будет спроектирована так, чтобы точно модулировать поток роста по сравнению с производственными путями в ответ на стрессовое состояние клетки, тем самым оптимизируя общий урожай.

Изучение пластичности сигнальных путей и того, как их функции могут быть настроены, также имеет отношение к патологии и лечению заболеваний. Многие виды рака обладают онкогенными мутациями, которые эффективно «переплетают» сигнальные сети клеток, контролирующие баланс между ростом, дифференцировкой и гибелью клеток [7]. Точно так же многие внутриклеточные патогены, включая бактерии и вирусы, производят специфические белки, которые «переплетают» эндогенные сигнальные пути [7]. 8–10]. Многие белки бактериальных патогенов, которые взаимодействуют с клеточной сигнальной киназой и путями регуляции актина, часто для подавления иммунного ответа хозяина или усиления инфекции (см. Дополнительную вставку 1).Таким образом, используя синтетическую биологию для понимания пластичности путей и того, как их поведение изменяется из-за сетевых возмущений, мы можем получить лучшую основу для понимания стратегий, которые патоген принимает для использования внутренней уязвимости сигнальных сетей. Более того, мы можем разработать стратегии для возврата больной сети к стабильному, непатологическому поведению. Наиболее стабильные методы лечения на основе сети могут включать не просто блокировку первичного онкогенного белка лекарством, а изменение структуры сети таким образом, чтобы она располагалась в новой и стабильной области поведенческого пространства.

Применение инженерной передачи сигналов в терапии и биотехнологии

Еще одним мотивом для разработки сигнального поведения клеток является возможность конструирования клеток, запрограммированных для выполнения точно разработанных приложений (). Представьте себе, если бы мы могли имитировать и превзойти эволюцию, используя набор молекулярных компонентов для генетической инженерии клеток, которые выполняют индивидуально разработанные реакции. По мере развития биологии стволовых клеток [11–12] и развития таких методов, как адоптивная иммунотерапия [13–14], возможность использования клеточной терапии становится все ближе, но это потребует сложной клеточной инженерии для точного контроля поведения клеток.Например, без нового контроля, как может быть направлена ​​правильная миграция и дифференцировка стволовых клеток для регенеративной медицины при отсутствии нормальных сигналов развития? Более того, по мере того, как все больше промышленных производственных процессов задействуют биологические организмы (такие как производство биотоплива или материалов) [15], может появиться возможность разработать более разумные производственные штаммы, которые, как и макроскопические производственные объекты, будут иметь системы клеточного контроля, которые отслеживают внешние и внутренние состояния для оптимизации производство.Это может быть особенно важно, поскольку мы просим ферментирующие организмы, такие как дрожжи, производить широкий спектр материалов, которые могут оказывать токсическое действие.

Разработанные противораковые клетки

Если мы сосредоточимся на разработке индивидуальных терапевтических клеток, которые могут воспринимать сигналы болезни и выполнять целенаправленные и точно откалиброванные терапевтические программы, какое поведение мы хотели бы? Иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты или естественные клетки-киллеры, можно модифицировать для идентификации и уничтожения опухолевых клеток.Такие клетки уже можно удалить у пациентов, генетически модифицировать, размножить ex vivo и адаптивно перенести обратно пациенту [16-17]. Противораковая клетка может быть разработана для обнаружения комбинации сигналов, связанных с опухолью, включая специфические опухолевые антигены, гипоксию, органоспецифические антигены, а также специфические факторы роста и цитокины, которые секретируются опухолями, чтобы избежать нормальных иммунных ответов и создать микроокружение, способствующее развитию опухолей [18],. Инженерные клетки, которые распознают эти факторы, но связаны с противоопухолевым ответом, были бы идеальными.Также критически важно разработать внешний контроль (например, небольшую молекулу) или предохранительные переключатели для этих терапевтических клеток, чтобы их поведение можно было отключить или ослабить в ответ на нежелательные побочные эффекты, или чтобы титровать величину их реакции.

Сконструированные клетки, которые обнаруживают эти специфические для опухоли входные данные, могут быть сконструированы для получения ряда различных ответов, таких как производство агентов визуализации, которые помогают в идентификации опухолей и метастазов, и контроль эндогенных иммунных клеточных реакций, таких как хемотаксис, фагоцитоз и убийство клеток.Возможно, наиболее важно то, что эти терапевтические клетки могут быть запрограммированы на секретирование факторов, нарушающих локальное микроокружение опухоли, таких как провоспалительные цитокины и факторы антиангиогенеза, что делает их непригодными для устойчивого роста опухоли. Это было бы эквивалентно созданию специальной иммунной клетки, которая выводит из строя опухолевые клетки и микроокружение на нескольких уровнях.

Направленная иммуносупрессия

Иммунная клетка также может быть разработана для блокирования аутоиммунного заболевания или отторжения трансплантированных органов.Обычная иммуносупрессивная лекарственная терапия имеет широкие и серьезные системные эффекты. Сконструированная клетка может быть запрограммирована на местную иммуносупрессивную реакцию, возможно, в ответ на специфические аутоиммунные антигены или антигены трансплантата в сочетании с цитокиновыми сигнатурами сильного аутоиммунного ответа. Такие клетки могут быть запрограммированы на хемотаксис к участкам этих сигналов и реагировать путем секреции противовоспалительных цитокинов, которые отключили бы воспалительные петли положительной обратной связи, которые обычно приводили бы к полномасштабной аутоиммунной реакции или реакции отторжения.

Хотя индивидуально разработанные терапевтические клетки — это будущее, полезно подумать о том, какое поведение обнаружения и реакции будет ценным, так как они обеспечивают полезные целевые вехи в разработке инструментов и стратегий для перестройки клеток.

Можно ли проектировать сети передачи сигналов сотовой связи?

Существуют большие разногласия относительно того, действительно ли элементы можно спроектировать. Системы клеточной сигнализации настолько тонко оптимизированы, что наше вмешательство приведет к катастрофическим сбоям, или настолько надежно спроектированы эволюцией, что добавление новых генов и сетевых связей не сможет существенно изменить функцию? Очевидно, что эволюция смогла перестроить клеточные сигнальные пути, чтобы получить разнообразные ответы — на определенном уровне они относительно пластичны и эволюционируют.Таким образом, прежде чем пытаться создать новое клеточное поведение, может быть поучительно подумать о том, как эволюция может достичь инновационных новых функций.

Отличительной чертой сигнальных белков, которая, как полагают, играет важную роль в эволюции, является их модульная структура. Они почти всегда состоят из множества модульных доменов, некоторые из которых выполняют каталитическую функцию, а многие — специфические регуляторные функции или функции взаимодействия [19, 20]. Эти модульные домены встречаются в различных сигнальных белках в самых разных комбинациях.Это привело к модели, согласно которой разнообразие сигнальных функций может развиваться посредством рекомбинации этого набора доменов. Таким образом, в принципе, если бы мы могли понять, как эволюция работает с этими модулями, мы могли бы использовать тот же набор инструментов, чтобы найти области пространства поведения, которые эволюция, насколько нам известно, еще не исследовала.

Почему сигнальные белки и системы настолько модульны? Большинство согласны с тем, что в эволюционной временной шкале организмы находятся под давлением приспособленности к развитию инновационных клеточных сигнальных реакций, которые могут привести к преимуществам в изменяющейся окружающей среде и по сравнению с конкурирующими организмами.Под воздействием такого рода изменяющегося давления приспособленности модульные системы могут спонтанно развиваться как способ облегчить более быструю диверсификацию функций [21]. Алон и его сотрудники смоделировали эволюцию биологической сети, используя эволюционные алгоритмы для поиска простых вычислительных сетей, которые решают поставленную цель [22]. Когда они неоднократно меняют целевую цель, результирующие сети спонтанно развивают более модульные решения — сети, которые имеют внутри себя функциональные подсети. Эти заранее сформированные подсети — модули — могут быть быстро переподключены новыми способами для перехода от одной целевой функции к другой.По сути, кажется, что модули предоставляют способ быстро перемещаться из одного функционального пространства в другое, перепрыгивая через обширные области нефункционального сетевого пространства. Таким образом, модульная организация сигнальных белков и сетей может отражать давление на эти системы с целью создания поведения, которое соответствует потребностям постоянно меняющейся среды.

Важность модульности в облегчении эволюции новых функций согласуется с концепциями эволюции и развития, в которых утверждается, что большая часть диверсификации функций и морфологии организмов эволюционирует через альтернативное регулирование существующих компонентов, а не на изобретение принципиально новых компонентов [23].Хотя многие из этих идей были разработаны с упором в первую очередь на регуляцию генов с помощью различных цис-действующих модулей, они также могут применяться к регуляции ключевых каталитических сигнальных модулей с помощью разнообразных локализационных и регуляторных модулей [24,25]. Неудивительно, что многие из усилий по разработке нового сигнального поведения, описанного ниже, используют стратегии рекомбинации модульных функциональных единиц новыми способами, таким образом, по сути, используя эволюционную стратегию для создания новой функции.

Разработка новых сенсорных систем

Одним из наиболее важных инструментов для изменения поведения клеток будет способность создавать новые датчики и рецепторы для целевых входов.Однако это, пожалуй, наименее охарактеризованный элемент в инженерии клеточной сигнализации, потому что вселенная возможных входов настолько обширна и часто включает проблему работы с относительно сложными мембранно-ассоциированными мембранными белками. Ниже мы описываем недавний прогресс в модификации или конструировании различных рецепторных молекул.

Перенаправление выхода естественных рецепторов

Природные рецепторы, которые обнаруживают специфические эндогенные входы, могут быть спроектированы для генерации неродной выходной реакции.Есть несколько примеров перенаправления нативного рецептора, чтобы вызвать новый транскрипционный ответ. Один из таких подходов использует модульную структуру рецепторного белка Notch. Notch — это трансмембранный рецептор, который обнаруживает белок Delta, присутствующий на соседних клетках, — критический канал межклеточной коммуникации в развитии и дифференцировке. Когда Delta связывает Notch, трансмембранная область Notch расщепляется мембранной протеазой, высвобождая C-концевой домен Notch в цитоплазму.Этот домен может проникать в ядро ​​и активировать транскрипцию гена. Struhl et al. Показали, что этот модуль фактора транскрипции рецептора notch может быть заменен синтетическим фактором транскрипции (Gal4-AD), так что при активации in vivo этот химерный рецептор notch может активировать гены, нацеленные на новый фактор транскрипции [26 , 27]. Хотя эту конструкцию использовали в качестве репортера для активации Notch, ее можно было легко использовать для связывания обнаружения нативного дельта-лиганда с совершенно новым набором ненативных генов-мишеней.

Barnea et al. Расширили эту модульную стратегию, вдохновленную Notch, путем создания новых транскрипционных выходов для других рецепторов, которые обычно не используют этот тип механизма активации протеаз [28]. Когда рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), активируются своими специфическими лигандами, они часто рекрутируют β-аррестин, который участвует в подавлении передачи сигналов GPCR. Barnea et al. Слили аррестин с высокоспецифичной протеазой вируса травления табака (TEV), так что он был совместно задействован в активированных GPCR.Синтетический фактор транскрипции также был слит с цитоплазматическим хвостом GPCR, связанным сайтом расщепления TEV. Таким образом, когда сконструированный слитый белок GPCR активируется своим эндогенным лигандом, он рекрутирует партнера протеазы аррестин-TEV, который расщепляет и высвобождает домен фактора транскрипции из GPCR, посредством чего он может проникать в нуклеазу и активировать гены-мишени. Эта система успешно использовалась для связывания новых репортеров транскрипции с активацией широкого спектра специфических GPCR.Ответ очень специфичен благодаря специфичности расщепления TEV. В принципе, эту стратегию можно использовать для связывания любого эндогенного сигнала, опосредованного GPCR, с экспрессией желаемых генов-мишеней.

Barnea et al. Также использовали эту стратегию для связывания передачи сигналов эндогенной рецепторной тирозинкиназы (RTK) с новыми выходами транскрипции [28]. Большинство RTK при стимуляции активируют свои киназные домены, которые опосредуют аутофосфорилирование цитоплазматических тирозинов для рекрутирования белков, содержащих домен Sh3.Здесь протеаза TEV была слита с рекрутированными доменами Sh3, а синтетический фактор транскрипции был слит с цитоплазматическим хвостом RTK через сайт расщепления протеазой TEV. Итак, активация RTK ведет к рекрутированию слияния Sh3-домен-TEV, высвобождению ассоциированного с рецептором фактора транскрипции и транскрипции гена инженерии. Примечательно, что эта простая модульная стратегия может быть применена к нескольким классам рецепторов, если они привлекают определенный белок-партнер при активации.

Howard et al. Использовали модульность передачи сигналов RTK для перенаправления сигнала онкогенного роста на апоптотический ответ [29]. Они сконструировали новый адаптерный белок Sh3, в котором домен Sh3, распознающий активированный RTK, был слит с доменом эффектора смерти от Fadd. Таким образом, активация RTK привела к рекрутированию в мембрану домена смерти, что вызвало ответ клеточной смерти. Возможность увязки других новых результатов с этими ключевыми событиями найма еще недостаточно изучена.

Рецепторы, которые обнаруживают новые входные данные малых молекул

Вышеупомянутые стратегии сосредоточены на способах получения рецепторов, которые обнаруживают эндогенные сигнальные молекулы, и конструируют их так, чтобы вызывать новые ответы. Однако во многих случаях для клеточной инженерии могут потребоваться рецепторы, которые обнаруживают новые сигналы, для которых нет эндогенных рецепторов. Эти новые сигналы включают в себя небольшие молекулы, которые мы можем захотеть обеспечить внешнее управление инженерной системой.

Относительно хорошие успехи были достигнуты в использовании GPCR в качестве платформы для конструирования контролируемых рецепторов на малых молекулах.Некоторые GPCR, такие как опиоидные рецепторы, могут активироваться их эндогенными лигандами и специфическими низкомолекулярными агонистами. Конклин, Рот и его сотрудники сконструировали молекулы, известные как рецепторы, активируемые исключительно синтетическими лигандами (RASSL) [30,32]. Эти рецепторы мутированы так, что они не могут связывать свой эндогенный лиганд, но активируются и вызывают свой эндогенный нисходящий эффект в ответ на небольшой фармакологически инертный молекулярный агонист.

GPCR различаются по своим выходам, отчасти потому, что отдельные рецепторы связываются со специфическими гетеротримерными G-белками.Дальнейшая разработка дала версии RASSL, которые специфически связаны с каждым из этих отдельных нисходящих путей, тем самым позволяя малым молекулам контролировать очень разнообразный набор выходов. Эти RASSL были успешно применены у трансгенных мышей — по сути, перестраивая передачу сигналов в полноценном живом организме — в основном в качестве диагностического и аналитического инструмента. Применение было разнообразным, учитывая широкое использование GPCR в разных тканях. Например, мыши, несущие вкусовые нейроны, экспрессирующие RASSL, проявляли специфические сладкие (привлекательные) или горькие (аверсивные) ответы на воду, смешанную с агонистом (спирадолином), в зависимости от того, в каком типе нейрона они экспрессировались [33].Кроме того, экспрессия RASSL в клетках сердца позволяет контролировать частоту сердечных сокращений путем введения спирадолина [34]. То, что эти рецепторы in vivo так надежно работают, , намекает на их потенциальную полезность в более сложной клеточной инженерии.

Химические димеризаторы образуют другую стратегию достижения контроля малых молекул над передачей сигналов. Такие стратегии были рассмотрены в другом месте [35,36] и не будут здесь обсуждаться.

Рецепторы, которые обнаруживают определенные пользователем антигены

Было бы идеально разработать рецепторы, которые могут воспринимать ассоциированные с заболеванием антигены, такие как белок, сильно экспрессирующийся в опухоли или инфекционном агенте.Если бы рецепторы могли быть сконструированы для достижения такого же разнообразия и избирательности распознавания, что и антитела, можно было бы обнаруживать широкий спектр входных сигналов и связывать их с конкретными ответами. Химерные антигенные рецепторы (CAR) — рецепторы, созданные с использованием одноцепочечных антител (scFv) как часть механизма их обнаружения, — были разработаны как универсальный каркас этого типа. Эта стратегия проистекает из модульности рецепторов иммунных клеток, таких как рецептор Т-клеток. Хотя Т-клеточный рецептор представляет собой сложный мультибелковый комплекс, сшивания цитоплазматической области субъединицы дзета-цепи CD3 достаточно для индукции передачи сигналов Т-клетками [37].Дзета-цепь CD3 содержит мотивы, которые фосфорилируются при активации тирозинкиназами, такими как Lck, для индукции рекрутирования белков, содержащих домен Sh3, таких как киназа ZAP-70. Слияние цитоплазматической области дзета-цепи CD3 с внеклеточным одноцепочечным антителом (scFv) дает рецептор, часто называемый «Т-тельцем», который при экспрессии в Т-клетках приводит к целенаправленному уничтожению клеток, экспрессирующих узнаваемый антиген (предположительно, поверхностные антигены сшивают и активируют химерные рецепторы) [38,39].Слияние scFv с внутриклеточной областью рецептора Fc (гамма-цепь) может дать химерный антиген-чувствительный рецептор аналогичного типа. Эти исследования подчеркивают модульность этих рецепторов: соединение нового внеклеточного распознающего элемента с нижележащими внутриклеточными сигнальными элементами приводит к новому датчику ввода / вывода.

Эти CAR первого поколения относительно примитивны и дали неоднозначные результаты. Т-клетки, экспрессирующие CAR, направленные против опухолевых антигенов, обладают умеренной сигнальной способностью по сравнению с эндогенными ответами TCR, умеренно пролиферируют ex vivo и in vivo и имеют низкую выживаемость при многократном воздействии антигена [16,17]].Улучшения в этом поведении были сделаны путем включения дополнительных модульных доменов во внутриклеточные области CARs, включая домены от молекул корецепторов, которые являются частью нормальной активации TCR, таким образом, возможно, имитируя более полную активированную внутриклеточную сборку [40,41]. Клетки, содержащие CAR следующего поколения, более эффективно контролируют опухоли ксенотрансплантата у мышей, и в настоящее время переносятся на клинические испытания [16]. Более сложная инженерия CAR может привести к еще большему улучшению терапевтической функции.

Датчики, которые обнаруживают физические сигналы, такие как свет

Еще одна интересная область исследований — разработка генетически закодированных датчиков, которые могут обнаруживать свет и преобразовывать его в конкретный биологический ответ, область, называемая оптогенетикой. Встречающиеся в природе светочувствительные белки растений, водорослей и бактерий можно модифицировать для использования в высших организмах, включая млекопитающих. Эти инструменты чрезвычайно полезны в качестве пространственно-временных шкал для контроля и анализа сложного клеточного и организменного поведения, особенно когда они экспрессируются с помощью промоторов, специфичных для клеточного типа.В долгосрочной перспективе оптогенетические инструменты могут использоваться для удаленного контроля клеток, используемых в терапевтических целях, хотя существуют серьезные технические проблемы, такие как то, как свет может доставляться в организм, которые необходимо будет преодолеть. Наиболее часто используемые сегодня оптогенетические инструменты — это белки микробного канала родопсин и галородопсин, которые широко используются для контроля функции нейронов. Они рассмотрены в другом месте [42] и не будут здесь подробно обсуждаться.

Совсем недавно появились дополнительные оптогенетические инструменты, которые могут быть применены к более широкому спектру клеточных сигнальных систем.Airan et al. Сконструировали набор активируемых светом GPCRs, которые могут связываться как с нижележащими Gs, так и с гетеротримерными G-белками Gq [43]. Были созданы химеры светочувствительной зрительной системы GPCR, родопсин (бычий), которые содержат внутриклеточные петли от Gq- и Gs-сопряженных адренергических рецепторов. Эндогенная молекула сетчатки — это светочувствительный хромофор. Эти новые инструменты значительно расширяют «словарь» передачи сигналов, которым можно управлять с помощью света, учитывая важность путей передачи сигналов Gq и Gs в различных типах клеток.

Еще более обобщенная стратегия управления светом включает использование контролируемых светом белковых взаимодействий. Временное взаимодействие конкретных белков-партнеров является основой многих внутриклеточных сигнальных событий (см. Ниже), и рецепторы могут быть обойдены, так что свет напрямую контролирует такие внутриклеточные взаимодействия. Левская и др. Использовали систему взаимодействия фитохрома, полученную из растений — связывание этого фоторецептора с его партнерским доменом PIF может включаться и выключаться с помощью определенных длин волн света — для рекрутирования определенных белков на мембрану точным пространственно-временным образом [44].В случае факторов обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), которые контролируют GTPases семейства Rho, это может быть использовано для запуска активации GTPase и последующих изменений цитоскелета, приводящих к световодному выпячиванию клеток. Хотя этот метод является мощным и потенциально применимым ко многим сигнальным взаимодействиям, система Phy-PIF требует добавления проницаемого для клетки хромофора, который не является эндогенным для клеток млекопитающих. Wu et al. Использовали светочувствительный домен LOV (свет-кислород-напряжение) (обнаруженный в растениях, водорослях и бактериях) для конформационной закупорки Rac GTPase контролируемым светом способом [45].Этот связывающий флавин домен обеспечивает еще один потенциально общий конформационный элемент управления светом, который может быть связан для управления различными сигнальными белками.

Инженерные системы обработки сигналов

В конечном итоге клетки решают, какие программы ответа выполнять на основе внутриклеточных сигнальных сетей, которые принимают и обрабатывают сигналы от сенсорных молекул (см. Выше). Недавняя работа в области сотовой инженерии была сосредоточена на понимании того, как эти сети функционируют для принятия решений и как их можно изменить.

Модульная логика обработки сигналов

Внутриклеточные сигнальные белки имеют высокую модульность (см. Выше). Большинство модулей делятся на два класса (). Первый класс — это ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, которые катализируют посттрансляционные модификации или конформационные изменения, с помощью которых сохраняется информация. В большинстве случаев эти каталитические домены входят в пары: ферменты-писатели (например, киназы) производят модификацию, а ферменты-стиратели (например, фосфатазы) удаляют модификацию.Второй класс — это регуляторные домены или домены взаимодействия, которые модулируют активность каталитических доменов или нацеливают их на конкретных партнеров или сайты в клетке. Эти модули могут опосредовать специфические белок-белковые взаимодействия (либо конститутивные взаимодействия, либо те, которые зависят от посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование) или белок-мембранные взаимодействия. Таким образом, именно регуляторные домены и домены взаимодействия определяют, когда и где активируются каталитические домены и каким партнерам они передают информацию [5].

a | ферментных и регуляторных доменов . Модульные сигнальные белки эукариот обычно состоят из ферментативных доменов и доменов локализации. Ферментные домены, такие как киназы и фосфатазы, а также GEF и GAP, катализируют регуляторные модификации, такие как фосфорилирование и активация GTPase, соответственно (ферментные домены часто входят в пары «писатель» и «стиратель», которые имеют противоположные активности).Эти ферментные домены регулируются и нацелены на домены взаимодействия, включая домены межбелкового взаимодействия, домены мембранного взаимодействия или трансмембранные домены.

b | различных классов многодоменных архитектур . Ферментативные домены могут быть непосредственно нацелены на определенные субстраты, партнеров или субклеточные участки посредством доменов взаимодействия. В качестве альтернативы они могут быть косвенно нацелены через адаптеры или белки каркаса, которые содержат несколько доменов взаимодействия.Домены взаимодействия могут также аллостерически регулировать каталитические домены, участвуя во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях. Такие переключающие белки могут быть активированы конкурирующими лигандами, которые снимают аутоингибирование.

Эти разные классы модулей обнаруживаются в различных комбинациях и расположениях в сигнальных белках (). Каталитические домены, слитые с нацеливающими доменами, могут быть задействованы в определенных комплексах или участках мембраны, где они будут модифицировать определенные мишени; часто эти каталитические домены имеют высокую внутреннюю константу Михаэлиса (Km’s и, следовательно, требуют нацеливания с помощью дополнительных доменов взаимодействия для эффективного катализа.Иногда эти нацеленные взаимодействия регулируются, если, например, взаимодействие зависит от посттрансляционной модификации, такой как нацеливание белков домена Sh3 на аутофосфорилированные сайты pTyr на активированных RTK. Белки с двумя доменами взаимодействия могут действовать как адаптеры, которые переводят одно взаимодействие во второе, что приводит к увеличению гибкости ответа в зависимости от адаптерных белков, которые экспрессируются в конкретном типе клеток. Белки с множественными доменами взаимодействия могут также функционировать как скаффолдные белки, которые организуют несколько белков на пути в комплекс.Эти взаимодействия могут быть конститутивными или предопределенными, или индуцированными такими факторами, как фосфорилирование или конформационные изменения, которые открывают сайты взаимодействия. Таким образом, каркасные белки могут в принципе определять проводные связи сигнальных белков, а также контролировать, когда и где происходит передача сигналов [24, 20].

Вторая важная роль взаимодействия и регуляторных доменов — это непосредственный контроль активности каталитических доменов. Во многих случаях домены взаимодействия участвуют во внутримолекулярных аутоингибиторных взаимодействиях, которые стерически закрывают каталитический домен или конформационно возмущают его — тип регуляции, называемый модульной аллостерией [46].Связывание конкурирующих межмолекулярных лигандов с доменами взаимодействия индуцирует каталитическую активность белков. Часто множественные домены взаимодействия участвуют в автоингибировании каталитического домена кооперативным или иерархическим образом [47, 48]. Эти белки могут функционировать как сложные переключатели с множеством входов, которые требуют определенной комбинации входов для правильной активации. Кроме того, поскольку внешние лиганды активируют эти белки, локализация (управляемая этими взаимодействиями) может быть напрямую связана с активацией.

Разработка новых белковых переключателей

Лим и его сотрудники исследовали, можно ли использовать модульную аллостерическую логику многих природных эукариотических сигнальных белков для создания новых сигнальных переключателей путем рекомбинации доменов (). В самом деле, каталитические домены актинового регуляторного белка N-WASP и GEF семейства Rho могут быть связаны с новыми аутоингибиторными доменами с образованием белков, активность которых регулируется новыми лигандами [49,50]. Внутримолекулярное связывание любого из этих каталитических доменов с доменом PDZ и пептидом лиганда PDZ может давать переключатель, который активируется конкурирующим пептидом PDZ.Точно так же можно добавить несколько доменов взаимодействия, чтобы получить комбинаторный переключатель, отображающий управление логическим элементом И. В зависимости от точной конфигурации доменов и внутримолекулярных взаимодействий типы регуляции могут быть разными в ответ на разные конкурирующие внешние лиганды — один лиганд может активировать белок, а другой репрессировать его. Эти типы разнообразных взаимоотношений между регуляторными доменами напоминают разнообразное поведение, наблюдаемое в природных сигнальных белках, подтверждая представление о том, что этот вид архитектуры переключения облегчает эволюцию разнообразных комбинаторных регуляторных переключателей [48].Dueber et al. Также показали, что синтетические аутоингибирующие переключатели, использующие поливалентные взаимодействия одного и того же типа, приводят к переключениям, поведение активации которых может быть настроено кооперативно от линейного до цифрового ответа [51].

a | инженерных переключателей аллостерических белков . Dueber et al [49,51] показали, что аллостерическая регуляция сигнального белка N-WASP может быть перепрограммирована путем рекомбинации каталитического домена из N-WASP с различными комбинациями доменов взаимодействия.Новые модели поведения включали управление с множеством входов (логический элемент И) и активную активацию, подобную переключателю.

b | с использованием белков каркаса в качестве молекулярной печатной платы для преобразования выходных сигналов . Связь входа / выхода киназного пути MAP в дрожжах может быть перенаправлена ​​через сконструированный химерный каркас, который собирает новую комбинацию киназ [58]. Новые сайты взаимодействия также могут быть добавлены к каркасам для привлечения дополнительных модулирующих факторов.Эти дополнительные факторы могут быть построены синтетическими петлями обратной связи, которые могут быть использованы для создания путей, которые отображают разнообразную динамику передачи сигналов [62].

Каркасные белки как молекулярные схемы

Цепи внутриклеточной передачи сигналов также можно напрямую контролировать, используя регуляторные взаимодействия для перепрограммирования соединений путей. Например, каталитический домен киназы семейства Src, Hck, который обычно регулируется доменами Sh3 и Sh4, может быть слит с доменом PDZ и направлен in vivo для специфического фосфорилирования субстратов с мотивом лиганда PDZ [52].

Белки каркаса также могут быть использованы для создания новых взаимосвязей между входом и выходом пути. У дрожжей существует множество функционально различных киназных путей митоген-активированного протеина (MAP), которые регулируют ответы на феромон спаривания и осмотический стресс [53,54]. Эти пути имеют общие компоненты киназ, но остаются специфическими, потому что каждый путь организован отдельным каркасным белком [55–57]. Химерный каркасный белок, который организует избранных членов путей спаривания и осмотического стресса, дает неприродный путь, в котором феромон спаривания специфически индуцирует программу реакции осмостресса в vivo [58].Подобные ковалентные слияния, которые, подобно каркасу, вызывают взаимодействие между двумя сигнальными белками, могут быть использованы для принудительной передачи сигнала по единственному пути [59].

Совсем недавно было показано, что каркасные белки не только опосредуют линейные отношения ввода / вывода путей, но также координируют набор модуляторных факторов, которые формируют дозовую зависимость и динамику ответа пути [60,61]. Вдохновленный этими природными примерами, Башор и др. Показали, что дрожжевой скаффолд MAP-киназы, белок Ste5, можно использовать в качестве молекулярной печатной платы, чтобы гибко изменять количественное поведение реакции спаривания [62].Слияние дополнительного сайта синтетического взаимодействия с каркасом Ste5 (с использованием пары гетеродимеров лейциновой застежки) способствует привлечению новых модулирующих факторов, таких как фосфатаза MAPK, которая подавляет ответ пути. Однако, если экспрессия и рекрутирование фосфатазы связаны с выходным сигналом пути, возникает петля отрицательной обратной связи, которая приводит к адаптации — временный ответ, за которым следует автоматический возврат к более низким уровням выхода, что является ключевым поведением во многих биологических сенсорных системах.Связывая по-разному положительные и отрицательные модуляторы пути, этот небольшой набор элементов управления каркасом может быть использован для генерации очень разнообразных дозовых реакций и динамического поведения, включая высоко кооперативное переключение, отложенные ответы, ускоренные ответы и генерацию импульсов. Эти исследования показывают, как организующие центры, такие как каркас, являются богатой платформой для обработки и формирования внутриклеточной передачи сигналов посредством эволюции или инженерии.

Инженерная пространственная самоорганизация

Один из наиболее плохо изученных аспектов передачи сигналов в клетке — это то, как контуры, состоящие из диффундирующих молекул, могут приводить к высокоточной пространственной организации в клетке, такой как направленная поляризация и миграция.Этот тип самоорганизации является аспектом схемы управления, где нет хороших электронных или инженерных аналогов, и где биология может обучать инженерии.

Инженерные принципы применяются для понимания механизма поляризации почкующихся дрожжей, S. cerevisae . Поляризация контролируется GTPase Cdc42, которая в конечном итоге локализуется в одном сайте материнской клетки, приводя к образованию единственной почки, которая врастает в дочернюю клетку [63].Примечательно, что этот процесс приводит к образованию единственной бутоны почти со 100% надежностью. Цепь положительной обратной связи с участием Cdc42 GTPase является ключевой в поляризации: активный Cdc42 на мембране рекрутирует цитоплазматический белок GEF Bem1, который активирует и локализует дополнительный Cdc42 [64]. Хотя этот вид петли обратной связи ведет к образованию фокусов Cdc42, быстрая диффузия и перераспределение Bem1 между конкурирующими фокусами может быть важным, чтобы позволить одному из фокусов стать доминирующим, что ведет к сингулярности почкования.Эффект замедления диффузии и перераспределения Bem1 за счет связывания его с трансмембранным мотивом был проанализирован [65]. Bem1, привязанный к мембране, может спасти летальность от нокаута Bem1, но не может подвергаться диффузии в цитоплазме. Вместо этого он доставлялся к плазматической мембране в везикулах через актиновые кабели (также координируемые фокусами Cdc42) и от мембранных фокусов посредством эндоцитоза и, таким образом, перераспределялся намного медленнее. Наблюдались серьезные дефекты сингулярности, такие как множество устойчивых конкурирующих фокусов Cdc42, и частота многопочкованных клеток увеличивалась до ~ 5%.Подобные исследования помогают выявить требования к точно контролируемой пространственной самоорганизации и предполагают, что мы можем научиться создавать сигнальные цепи, которые производят индивидуальные пространственные результаты с важным терапевтическим поведением (например, регенеративная медицина, которая требует определенной клеточной морфологии и ориентации).

Создание предсказуемой инженерии передачи сигналов

Исследования, приведенные выше, показывают, что сигнальные системы являются высокомодульными и пластичными и рекомбинирующие модули, особенно каталитические домены с новыми регуляторными доменами, могут приводить к отличному ответному поведению.Таким образом, вопрос уже не в том, можно ли спроектировать сигнальные системы для получения нового поведения, а в том, можно ли их спроектировать таким образом, чтобы мы могли предсказать, какое поведение проявится и насколько успешной будет каждая спроектированная схема.

Проблема непредвиденных перекрестных помех

Одна из основных проблем, связанных с передачей сигналов инженерной клетки, заключается в том, что естественные компоненты — инструментарий доступных доменов — повторно используются, что может привести к непредвиденным перекрестным помехам. Приведут ли инженерные взаимодействия, которые вы создаете, к специфическому фосфорилированию желаемого белка, или используемый домен также будет перекрестно взаимодействовать с другими мишенями, конкурентно титруя важные физиологические взаимодействия и приводя к непредвиденным эффектам или сбоям в спроектированной схеме? Часто природные части не обладают абсолютной специфичностью, и эволюция, скорее всего, использует сложные сети перекрестной реактивности, чтобы обеспечить важную скоординированную регуляцию.Хотя такая сложная система, похожая на нейронную сеть, может обеспечить преимущества для клетки, это проклятие для прогнозной инженерии.

Представляя будущий инструментарий сигнализации

Одним из решений этой проблемы является сборка инструментария из деталей, специально оптимизированных для проектирования. Этот вопрос важен для любого типа сигнальной части, но мы сосредоточимся на том, как собрать полезный инструментарий из частей, взаимодействующих с белками ().

Нативная клетка имеет свой собственный репетитор модулей взаимодействия с белками, и поэтому сложно разработать новые функции с использованием связанных модулей взаимодействия, которые могут показывать непреднамеренные и непреднамеренные перекрестные помехи в камере.Оптимизированный набор взаимодействующих частей может значительно повысить предсказуемость клеточной инженерии, исключив возможность непреднамеренных перекрестных помех. Несколько стратегий оптимизации включают разработку модулей взаимодействия, которые используют неиспользованную специфичность; разработка составных, многодоменных взаимодействий; объединение модулей взаимодействия с новым субклеточным нацеливанием; и импорт модулей ортогонального взаимодействия (либо созданных синтетически, либо из других организмов), которых нет в клетке-хозяине.

Хотя природа неоднократно использовала семейства частей, такие как домены взаимодействия определенного типа, недавние исследования показывают, что в некоторых случаях члены семейства содержат неиспользуемые сайты узнавания внутри этих доменов. Их можно использовать для создания пар домен-пептид, которые одновременно оптимизированы для взаимодействия со своим правильным партнером, избегая при этом перекрестного взаимодействия с другими членами семейства [66,67]. Фактически были сконструированы пары PDZ-домен-лиганд и гетеродимеризующиеся пары лейциновой застежки-молнии, которые оптимизированы, чтобы избежать перекрестной реакции с естественными доменами того же типа [68,69].Избирательность и предсказуемость существующих доменов взаимодействия также можно улучшить путем разработки составных взаимодействий. Конечно, многодоменное сотрудничество — естественный механизм повышения специфичности. Но новый поворот в этом вопросе — это разработка составных двухкомпонентных взаимодействий типа «раскладушка». Koide et al. Взяли домен PDZ и слили его с доменом фибронектина [70]. Используя фаговый дисплей, они отобрали варианты этого тандемного домена, которые связывают определенный пептид, так что он находится между двумя доменами.Резко увеличенная площадь распознавания приводит к взаимодействиям с гораздо более высокой специфичностью и сродством. Другое решение для специфичности, которое наблюдается в природе, — это дифференциальная компартментализация. Если нацеливающие мотивы могут быть использованы для локализации партнерских белков в определенных органеллах или клеточных участках, то мотивы взаимодействия, вероятно, будут функционировать более специфическим образом, особенно если в этом месте или органелле происходит мало или совсем не происходит конкурирующих взаимодействий этого типа.

Альтернативный подход к достижению надежной специфичности заключается в импорте доменов из других организмов, которых нет в создаваемом хозяине. Напр., PDZ домены могут быть импортированы в дрожжи (у которых отсутствует большинство таких доменов), хотя возможность случайных перекрестных реагирующих партнеров не может быть исключена [58]. Примером ортогональной молекулярной системы, которая была успешно перенесена на нового хозяина, является бактериальная рекомбиназная система Cre-Lox, которая надежно используется для создания сложных хромосомных перестроек в сложных организмах, включая мышей [71].

Таким образом, представляя инструментарий будущего, можно захотеть создать набор из десяти или около того пар взаимодействия белков, оптимизированных для конкретного выбранного организма (например, E.coli , S.cerevisae , млекопитающие) в том, что они ортогональны, то есть известно, что они не реагируют перекрестно с протеомом хозяина или белками в наборе инструментов, за исключением их родственного лиганда. Также важно, чтобы эти взаимодействия были настраиваемыми, поэтому серия лигандов для каждого домена взаимодействия, которые различаются по аффинности на несколько порядков, были бы идеальными.Это позволило бы систематически исследовать, как сродство вербовки меняет поведение системы.

Комбинаторный дизайн и прогнозирование

Другой другой, но все же дополнительный подход к предсказуемому проектированию передачи сигналов соты состоит в использовании комбинаторной изменчивости. В ходе естественной эволюции рекомбинация сигнальных модулей для генерации новой функции, по-видимому, не была спроектирована или направлена, а скорее была относительно случайной, и именно естественный отбор выявил события перепрограммирования, которые привели к преимуществам приспособленности.Таким образом, очень плодотворным подходом, учитывая отсутствие предсказуемости в клеточной инженерии, могло бы быть построение комбинаторных библиотек синтетических схем и выбор желаемой функции [25,72]. Более того, этот подход можно было бы комбинировать с полу- прогнозное проектирование, при котором могут быть разработаны общие архитектуры спроектированных схем, но комбинаторные методы используются для поиска в более широком диапазоне пространства параметров (с использованием вариантов каждого модуля в библиотеке). Сосредоточение внимания на комбинаторном выборе может также обеспечить очень полезную стратегию на заре синтетической биологии, поскольку это может помочь нам быстрее узнать о основных принципах проектирования.

Outlook

Цель понимания того, как клетки общаются и принимают решения, остается очень привлекательной, особенно потому, что понимание молекулярного языка внутри клетки может позволить нам общаться с клетками и инструктировать их выполнять новые запрограммированные функции. Наша способность перестраивать клеточную сигнализацию может обеспечить множество мощных приложений, таких как терапевтические клетки, запрограммированные на обнаружение селективного набора сигналов, связанных с заболеванием, и на локальный ответ точно настроенным образом.

Хотя эволюция достигла такого рода инноваций и точной инженерии клеточных функций, мы только начинаем понимать, как достичь такого рода цели. У нас есть хорошее фундаментальное понимание логики клеточных сигнальных механизмов и источников функциональной пластичности. Кроме того, были сделаны первые важные шаги в разработке новых рецепторно-сенсорных систем, а также новых или модифицированных схем обработки внутриклеточных сигналов. Несмотря на эти инструменты, на сегодняшний день было приложено очень мало усилий для того, чтобы связать эти типы компонентов новыми способами, чтобы получить более крупные интегральные схемы, способные давать очень точные и точные отклики.Такие усилия продолжаются. Например, Cell Propulsion Lab — это наномедицинский центр Национального института здравоохранения (http://nihroadmap.nih.gov/nanomedicine/devcenters/cellularcontrol.asp), который пытается использовать относительно простые противоопухолевые иммунные клетки, созданные с использованием синтетических рецепторов химерных антигенов ( CAR), и улучшают обработку их сигналов и набор ответов, которые они вызывают, чтобы оптимизировать клетки для экспансии ex vivo, , in vivo, выживания, противоопухолевой цитотоксичности и нарушения благоприятного микроокружения опухоли.Будет интересно увидеть, как будут развиваться эти типы усилий и как эти проблемы повысят сложность и надежность сотовой инженерии.

a | перенаправление собственных входов на новые выходы . С-концевой домен рецептора notch представляет собой фактор транскрипции, который высвобождается в результате трансмембранного протеолиза при активации лигандом дельта. Замена альтернативным доменом фактора транскрипции дает новый ответ экспрессии гена [26].Выход рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), может быть перенаправлен аналогичным образом путем слияния домена фактора транскрипции через привязку с сайтом протеазы TEV. Активация GPCR приводит к привлечению белка аррестина. Если в клетке экспрессируется слияние протеазы аррестин-TEV, активация GPCR приводит к высвобождению фактора транскрипции и новому выходу экспрессии гена [28]. Таким образом, активация GPCR может быть произвольно связана с новым транскрипционным выходом. Выход рецепторной тирозинкиназы (RTK) может быть перенаправлен за счет привлечения синтетических адаптеров домена Sh3 или PTB к активированному и фосфорилированному тирозин рецептору.Домен Sh3 может быть использован для рекрутирования протеазы TEV (чтобы снова высвободить искусственно связанный транскрипционный домен) [28] или для рекрутирования новых эффекторных доменов, таких как те, которые участвуют в гибели клеток [29].

b | инженерный новаторский контроль ввода для собственных ответов . GPCR были сконструированы так, чтобы их контролировали низкомолекулярные агонисты путем мутации их внеклеточной поверхности, так что они больше не связывают свои эндогенные лиганды (рецепторы, активируемые исключительно синтетическим лигандом — RASSL [32]).Рецепторы, которые активируют Т-клетки в ответ на произвольные входные данные, могут быть созданы путем слияния сконструированных одноцепочечных антител (scFv) с внутриклеточной областью Т-клеточного рецептора (дзета-цепь CD3), которые называются рецепторами химерных антигенов (CARs [16, 17]). Событие передачи сигнала, опосредованное рекрутингом, может быть помещено под световой контроль путем замены эндогенного взаимодействия на светозащитное взаимодействие, пара взаимодействий Phytochrome-PIF от растений [44].

a | Цепь поляризации дикого типа контролирует образование одиночных почек. В почкующихся дрожжах локализованная активация полярности GTPase Cdc42 усиливается петлей положительной обратной связи — активный Cdc42 рекрутирует каркасный белок Bem1, совместно собирает активированную p21 киназу (PAK — Ste20) и Cdc42 GEF (Cdc24). Хотя клетка может иметь несколько фокусов Cdc42, они быстро распадаются на один доминантный фокус, который развивается только в клетки. Предполагается, что быстрая скорость обмена диффундирующим комплексом Bem1 / PAK / GEF между конкурирующими фокусами Cdc42 является критической для разделения в один доминантный фокус.

b | синтетическая цепь медленной поляризации приводит к образованию множественных бутонов . Чтобы проверить эту гипотезу, Bem1 был искусственно привязан к мембране через слитый мотив нацеливания на мембрану [65]. Хотя этот связанный с мембраной Bem1 может должным образом собирать комплекс Bem1 / PAK / GEF на участках активности Cdc42 (т.е. петле положительной обратной связи), обмен комплексом между конкурирующими фокусами Cdc42 происходит медленно (зависит от везикулярного транспорта через актиновые кабели и эндоцитоза) .Эта синтетическая поляризационная схема, следовательно, приводит к плохому разрешению конкурирующих фокусов Cdc42 и гораздо более высокой частоте (5% против ~ 0%) многопучковых клеток (микрофотографии из [65]).

Ссылки

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Длина и временные масштабы сигнальных цепей клетка-клетка в агаре

Abstract

Сообщество генетически гетерогенных клеток, встроенных в несмешанную среду, позволяет выполнять сложные операции, сохраняя пространственную дифференциацию и координируя разделение труда.Чтобы установить принципы создания надежной связи между ячейками в гетерогенной среде, мы исследовали, как параметры схемы и пространственное размещение влияют на диапазон длин и временных масштабов, в которых взаимодействуют простые схемы связи. Мы сконструировали несколько штаммов «отправитель» и «получатель» с сигнальными цепями, определяющими кворум. Колония клеток-отправителей продуцирует ацилгомосериновые лактоны (AHL), которые диффундируют через полутвердую среду. Колония клеток-приемников обнаруживает эти сигнальные молекулы и сообщает о них по флуоресценции.Мы обнаружили, что одной колонии с одним вариантом отправителя достаточно, чтобы вызвать отклик получателя на расстоянии более 1,5 см. Кроме того, экспрессия деградазы AHL в принимающих колониях вызывает пороговый эффект сигнала и снижает уровень ответа в последующих принимающих колониях. Наконец, наше исследование пространственного размещения колоний привело к созданию многоклеточного массива дальней связи, состоящего из двух чередующихся типов колоний. Его сигнальный ответ успешно распространялся от колонии к колонии вдоль массива из шести колоний, охватывающего 4 человека.8 см при скорости передачи 12,8 часа на колонию или 0,075 см в час. Кроме того, мы разработали модель реакции-диффузии, которая воссоздает наблюдаемое поведение многих выполненных экспериментов с использованием оценок параметров диффузии сигнала, экспрессии генов и потребления питательных веществ на основе данных. Эти результаты демонстрируют, что смешанное сообщество колоний может дать возможность новым программам формирования паттернов, а соответствующая модель будет способствовать рациональному проектированию сложных коммуникационных сетей.

Введение

Исследования в области синтетической биологии включают определение эффективных алгоритмов и стратегий в живых системах и применение этих знаний в искусственном биологическом дизайне. Этот подход оказался успешным для небольших генетических цепей в однородных культурах, таких как логические сети и генераторы в бактериях [9, 17], но для выполнения более сложных задач потребуются продвинутые стратегии.

Одной из новых стратегий является микробный консорциум, создание множества генетически различных штаммов взаимодействующих микробов для достижения желаемой функции [5, 15].Смешанное сообщество сконструированных клеток может выполнять более сложные функции, чем гомогенная популяция, потому что разделение сложного пути между генетически различными, кооперативными популяциями облегчает торговлю устойчивостью-сложностью, связанную с синтетическими генными цепями [3, 16]. Нельзя недооценивать важность координации для микробных сообществ. От метаболических отношений разделения труда до условно-патогенных микроорганизмов человека, которые одновременно атакуют скомпрометированные ткани [12, 13], почти все микробы координируются внутри вида и между границами видов.Таким образом, установление принципов разработки надежного скоординированного поведения является важным шагом на пути к более продвинутым приложениям синтетической биологии.

Недавние исследования описали сконструированные синтетические консорциумы, способные к ряду скоординированных действий, таких как экологическая динамика [18], популяционная динамика [16] и формирование паттернов [3, 4, 7, 11]. В некоторых из этих работ к препаратам полутвердых сред были применены множественные штаммы микробов [3]. Пространственная неоднородность этих сред позволила обнаруживать полосу поведения [3] и могла позволить другие новые взаимодействия и сети формирования паттернов.Однако диапазон возможного расстояния и времени передачи данных в полутвердых средах явно не исследовался. Эта информация поможет обрисовать диапазон паттернов поведения, которые можно получить экспериментально с помощью простых взаимодействий и координации, обеспечивая основу для будущих исследований более сложных программ паттернов.

Здесь мы стремились исследовать инженерные принципы надежной связи между ячейками в гетерогенных средах сантиметрового масштаба.Мы исследовали, как параметры схемы и пространственное размещение влияют на диапазон длин и временных масштабов, в которых простые коммуникационные схемы взаимодействуют в полутвердой среде. Эти сигнальные цепи используют компоненты контроля кворума (QS) для программирования напряжений «отправителя» и «получателя» (рис. 1). Колония клеток-отправителей продуцирует сигнальные молекулы ацилгомосеринлактон (AHL), которые диффундируют через полутвердую среду. Колония клеток-приемников обнаруживает сигналы AHL и сообщает о них по флуоресценции. Мы настроили радиус передачи сигналов, максимальное расстояние, отделяющее колонию-отправитель от колонии-получателя, с которой она может связываться, путем изменения силы сайта связывания рибосомы (RBS) как в цепи отправителя, так и в цепи получателя.Мы обнаружили, что одной колонии с одним вариантом штамма-отправителя достаточно, чтобы вызвать ответ приемника на расстоянии более 1,5 см. Кроме того, мы продемонстрировали, что экспрессия деградазы AHL в принимающих колониях вызывает пороговый эффект сигнала и снижает уровень ответа в последующих принимающих колониях.

Пример собранной пары сигнальных цепей отправитель-приемник. В клетке-отправителе синтаза CinI продуцирует один тип сигнала AHL, который диффундирует через агар.В клетке-приемнике AHL связывает CinR с образованием комплекса, который активирует экспрессию GFP.

Основываясь на парадигме отправитель-получатель, мы стремились достичь более длинных расстояний передачи сигналов путем создания каскада связи, в котором AHL, излучаемый колониями-отправителями, инициирует передачу сигналов от соседних колоний-отправителей. Мы предусмотрели соединение отдельных колоний в сети связи, состоящей из двух ортогональных химических каналов, основанных на пространственной близости и разделении. Тамсир и др.ранее продемонстрировали аналогичную систему на основе колоний, которая была «подключена» к межклеточной связи на основе QS [19]. Однако относительная пространственная ориентация их колоний не имеет отношения к функции устройства, поскольку каналы связи различаются исключительно ортогональными химическими сигналами, а не пространственным разделением. В нашей работе мы демонстрируем систему, в которой намеренный пространственный образец имеет решающее значение для функционирования системы. Эта система состоит из массива из двух чередующихся типов колоний для связи на большие расстояния (рис. 2).Каждая колония в этой системе взаимодействует с соседней колонией для распространения сигнала колонии за колонией. Следовательно, для этого массива из шести колоний требуются только два ортогональных химических канала. Эта результирующая структура «проводки» может быть расширена до более крупных сигнальных сетей и схем в будущей работе.

Сигнальный массив состоит из двух чередующихся деформаций, так что обнаруженный и отправленный сигнал ортогонален в каждой колонии.

Rhl AHL: N-бутирил-L-гомосерин-лактон (C ₄ -HSL)

Cin AHL: N- (3-оксотетрадеканоил) -L-гомосерин-лактон (3-Oxo-C14-HSL)

Результаты

Цепь связи с датчиком кворума обеспечивает диапазон полезного расстояния отклика в полутвердых средах

Сначала мы охарактеризовали диапазон расстояния и времени отклика, которые могут быть достигнуты нашими схемами связи QS, путем тестирования различных схем двух вариантов деформации отправителя и четырех вариантов деформации приемника в Чашки с агаром Luria Bertani (LB).Три штамма-приемника были трансформированы цепями, которые различались только силой RBS (рис. 3) перед репортером зеленого флуоресцентного белка (GFP) и фактором транскрипции QS. Сравнение этих штаммов-получателей продемонстрировало, что обмен RBS значительно изменил радиус передачи сигнала ответа, как показано на фиг. 3. В этом эксперименте ряд колоний-отправителей с сильным вариантом RBS был засеян над строками колоний-получателей. Использование слабого RBS перед фактором транскрипции заметно увеличивало базальный уровень GFP и уменьшало ответ цепи.Эффект был достаточно значительным, чтобы сделать этот вариант бесполезным. С другой стороны, альтернативные RBS перед маркером GFP могут существенно повлиять на радиус передачи сигналов.

Чтобы проверить осуществимость сети связи на основе колонии, мы затем продемонстрировали, что отдельная колония-отправитель с сильным или слабым RBS, контролирующим производство синтазы, была способна генерировать ответы в полезных масштабах (рис. 4). В частности, одной колонии сильного отправителя было достаточно, чтобы вызвать ответ более чем на 1 в колонии сильного штамма-получателя.Расстояние 5 см. Это наблюдение показало, что связь между колонией в масштабе длины, необходимой для проектирования сети, возможна.

Эффекты сайтов связывания рибосом разной силы. Сильный: B0034, средний: B0032, слабый: B0033 [10] A . B0034 GFP, B0033 CinR B . B0032 GFP, B0034 CinR C . B0034 GFP, B0034 CinR

Колонии-получатели, отвечающие (GFP) на колонии с одним отправителем. На каждом изображении колония-отправитель была замечена между тремя линиями ячеек-получателей.

Приемник A: B0032 GFP, B0034 CinR

Приемник B: B0034 GFP, B0033 CinR

Приемник C: B0034 GFP, B0033 CinR, B0034 Колонки AiiA

Ухудшение состояния приемника в AHL пороговый эффект сигнала и задержка времени ответа

Мы также создали репортерные штаммы, которые конститутивно экспрессировали AHL-деградазу (AiiA) вместе с репортерной цепью. Колонии этого штамма начинают проявлять измеримую флуоресценцию в более поздний момент времени, чем сопоставимый приемник без экспрессии AiiA (рис. 5).Индукционная кривая колоний, экспрессирующих AiiA, характеризовалась начальным периодом без сигнального ответа, а затем следовало замедленное увеличение, сравнимое с таковым для обычных колоний-получателей (фиг. 6). Мы предполагаем, что экспрессия AiiA первоначально устраняет большую часть AHL до тех пор, пока не будет получено достаточное количество сигналов для насыщения ферментативной способности AiiA. Таким образом, экспрессия AiiA порогового уровня AHL и приводит к задержке ответа сигнала.

Задержка флуоресцентного ответа в принимающих клетках, которые продуцируют деградазу (справа в каждой паре), по сравнению с принимающими клетками без деградазы (слева в каждой паре).На этих кадрах изображения показаны четыре блока агара (обведены серыми пунктирными линиями) вышеуказанного макета. Позиции колоний-отправителей заштрихованы серым цветом.

Измеренная флуоресценция, усредненная по площади колонии. Измерения начинали после инкубации засеянных планшетов в течение ночи. Приемник, экспрессирующий AiiA, начал проявлять измеримую флуоресценцию в более поздний момент времени.

Приемные колонии, экспрессирующие AHL-деградазу, снижают сигнальный ответ в заблокированных приемных колониях.

Экспрессия AiiA в приемных колониях может влиять на сигнальный ответ в соседних колониях за счет снижения уровня AHL в окружающей области среды.Мы обнаружили, что соседние колонии были затронуты только в определенных ориентациях. Регулярные колонии-получатели оказались незатронутыми при размещении рядом с колониями, экспрессирующими AiiA, на том же расстоянии от ряда клеток-отправителей. Это было верно для колоний, обнаруженных на расстоянии одного шага (2,25 мм от центра к центру) от колоний, продуцирующих деградазу (рис. 7). Однако, когда ряд колоний, продуцирующих AiiA, был помещен между рядом колоний-отправителей и линиями обычных колоний-получателей, расстояние вызова было уменьшено в обычных колониях-получателях (рис. 8).

Отклик флуоресценции в обычных колониях-приемниках (слева в каждой паре) был постоянным в зависимости от близости к колониям, продуцирующим деградазу (справа в каждой паре). Этот рисунок представляет собой увеличенную версию рисунка 5 и соответствует той же экспериментальной схеме.

Колонии, продуцирующие деградазу (верхний ряд на правом изображении), снижали сигнальный ответ в последующих колониях-приемниках (отмечены по диагонали). Колонии-отправители (не показаны) были отмечены линией над положением колоний, продуцирующих деградазу.

Гетерогенный массив колоний распространяет сигналы AHL для связи на большие расстояния.

Мы исследовали более сложные консорциумы, в которых штаммы продуцируют и реагируют на молекулы AHL из двух ортогональных систем QS. Шаблон схемы, применяемый для создания этих штаммов консорциума, был таким, что присутствие AHL из одной системы QS приводило к продукции синтазы, соответствующей другой системе QS. На рисунке 2 изображена экспериментальная демонстрация, которую мы преследовали для этого консорциума.

Набор состоял из двух штаммов, занимающих чередующиеся позиции колоний вдоль линии. Один из штаммов экспрессировал синтазу Rh1 AHL при обнаружении Cin AHL, тогда как другой штамм экспрессировал синтазу Cin AHL при обнаружении AHL Rhl. Каждая колония в этой системе связывалась с соседней колонией другого типа для распространения сигнала. Всего в тестовой матрице было шесть колоний, и первая колония была индуцирована внешним добавлением Cin AHL. В нашем эксперименте массив колоний с межцентровым расстоянием 9.55 мм успешно продемонстрировали предложенное распространение сигнала от колонии к колонии (Рисунок 9).

Массив колоний засевали в день 0 и инкубировали при 37 ° Covernight. Сигнальная цепь была инициирована добавлением 25 мкл Cin AHL к первой колонии в правом нижнем углу массива в день 1 около 11 часов утра. Зеленые колонии экспрессируют GFP и Rh1 AHL-синтазу при обнаружении Cin AHL, в то время как красные колонии экспрессируют RFP и Cin AHL-синтазу при обнаружении Rh1 AHL.

Массив колоний с 3.Расстояние между центрами 18 мм на 4-й день. Формирование внутриклеточной петли положительной обратной связи между двумя типами колоний вызывало самоактивацию массива без внешней индукции первой колонии.

Мы протестировали несколько условий управления параллельно, чтобы убедиться, что коммуникационный массив ведет себя через задуманный нами механизм. Одна из серьезных проблем заключалась в возможности формирования петли положительной обратной связи между соседними колониями разных штаммов, приводящей к самоактивации коммуникационного массива.Мы наблюдали это явление, когда два типа колоний находились в физическом контакте (рис. 10). В этом случае массив колоний полностью ответил без внешней индукции первой колонии. Однако эта самоактивация не наблюдалась в коммуникационном массиве с расстоянием 9,55 мм (рис. 11). Его неиндуцированная контрольная матрица флуоресцирует только на фоновом уровне через четыре дня. Кроме того, два дополнительных контрольных набора показали, что сигнал преимущественно распространялся между соседними колониями.Когда одна колония любого типа отсутствовала в массиве, ответ на сигнал значительно уменьшился за пределами этого промежутка (Рисунок 11). Эти результаты подтвердили, что конкретное размещение колонии было решающим для распространения сигнала и что сигнал распространялся от колонии к колонии.

Массив колоний с расстоянием между центрами 9,55 мм на 4-й день. Неиндуцированный контрольный массив флуоресцирует только на уровне фона. (верхнее правое изображение) Когда вторая (нижнее левое изображение) или третья (нижнее правое изображение) колония отсутствовала в массиве, ответ на сигнал значительно уменьшился за пределами этого промежутка.

Гетерогенный массив колоний передает сигнальный ответ с постоянной скоростью

Анализ изображения подтвердил и количественно оценил последовательный сигнальный ответ, наблюдаемый в массиве из шести колоний, описанном в предыдущем разделе. Значения флуоресценции нормализовали и усредняли по площади колоний, обнаруженной в определенные моменты времени. На рис. 12 показаны результирующие средние значения флуоресценции во времени для каждой из шести колоний. Эти профили отклика напоминают индукционные кривые.Ответ предположительно инициировался, когда достаточный уровень сигналов AHL впервые достиг колонии, затем ответ линейно увеличивался с уровнем AHL, пока не достиг максимальной индукции, после чего значения флуоресценции стабилизировались.

Эти профили также четко отображают различия во времени начала ответа среди множества колоний. На рисунке 13 время отклика приблизительно равно времени флуоресценции колонии на 25% от максимального уровня, достигнутого в соответствующем канале.Все колонии вошли в индуцируемый диапазон профиля ответа при этом пороге. На рисунке 14 показано, что время отклика линейно увеличивается с числом колоний и что сигнал передается с постоянной скоростью 12,8 часа на колонию или 0,075 см в час.

Средняя нормализованная флуоресценция во времени для каждой из шести колоний. Подгоняемые кривые представляют собой полиномы 5-го порядка. Ответ сигнала распространяется от колонии 1 к колонии 6, что соответствует слева направо на этом рисунке. См. Рисунок 2 для построения массива колоний.

Сравнение аппроксимированных кривых средней нормированной флуоресценции во времени. Сигнальный ответ распространяется от колоний 1 до 6. См. Рисунок 2 для построения массива колоний.

Время, когда отдельные колонии флуоресцируют на 25% от максимального уровня, достигнутого в соответствующем канале.

Разрыв в профиле ответа колонии 1. Колония 1 была первой колонией в массиве и его центр был индуцирован внешним добавлением АГЛ. B Область разрыва кривой отклика. C Формирование структуры внутри колоний с течением времени.

В наборе данных очевидно несколько проблем. Во-первых, некоторые временные точки отсутствуют между 40 и 50 часами. Во-вторых, RFP-экспрессирующие колонии, пронумерованные 1, 3 и 5, давали средние значения флуоресценции с большим разбросом и шумом по сравнению с GFP-экспрессирующими колониями, потому что фильм демонстрировал высокочастотную циклическую сдвиг детектируемых значений флуоресценции в канале RFP.Наконец, профиль ответа колонии 1 содержит неожиданную прерывность, выделенную на рисунке 15 B. Неравномерность вызвана обнаружением и прогрессирующим формированием структуры между колониями. В более ранние моменты времени флуоресцирует только центр колонии 1, потому что к центру добавлялась внешняя AHL для инициирования распространения сигнала. Площадь этого флуоресцентного центра определялась и использовалась для нормализации значений флуоресценции. В более поздние моменты времени на краю колонии образовалась кольцевая структура, предположительно из-за обратной связи с соседней колонией (рис. 15 C).Как только структура внешнего кольца полностью сформировалась, для нормализации была обнаружена большая флуоресцентная область, что привело к внезапному снижению средних значений флуоресценции. Мы намереваемся решить эти проблемы в следующей серии экспериментов путем выборки полного набора временных точек, замены RFP на GFP и нормализации значений флуоресценции с использованием областей, обнаруженных на изображениях в ярком поле.

Модель

Благодаря этим экспериментам мы смогли количественно определить длину и временные масштабы коммуникации микробных консорциумов, встроенных в агар.Кроме того, мы разработали модель реакции-диффузии, которая отражает основные особенности, которые мы наблюдали в этих экспериментах. С помощью этой модели мы можем исследовать, как параметры, влияющие на экспрессию белка, рост клеток, восприятие сигнала и выработку сигнала, приводят к сигнальным каскадам. Модель также позволяет нам оценить концентрацию АГЛ как функцию времени и положения, что не может быть рассмотрено непосредственно в эксперименте.

Модель учитывает рост клеток, зависящий от питательных веществ, производство белка, зависимое от питательных веществ, синтез сигнала через синтазные белки, диффузию сигнала, диффузию клеток и диффузию питательных веществ.Поскольку схема относительно проста, мы выбрали для модели дискретное приближение непрерывной системы реакции-диффузии. При такой дискретизации пластина с агаром разделяется на камеры шириной 1 мм, длиной 1 мм и глубиной 5 мм, что соответствует глубине агара в экспериментах. Концентрация модельных видов принимает одно значение в каждом вокселе. Чтобы вычислить дискретизированное приближение диффузии, модель вычисляет скорость изменения концентрации молекул, применяя Первый закон Фикса к поверхностям, разделяющим смежные прямоугольные камеры.Для индексов (i, j) и (x, y) на сетке, определяющей расположение камер на пластине P, и ширину камеры w, вклад диффузии в дискретное приближение пространственной производной вида s принимает следующий вид:

Все остальные уравнения модели используют функции Хилла для моделирования нелинейной ограниченной активности, вызванной малыми молекулами.

В то время как производство белка и рост клеток зависят от наличия питательных веществ, только рост клеток фактически потребляет питательные вещества. Каждая производная от этих видов включает условия производства, которые пропорциональны параметру продукции, наличию питательных веществ в этой камере и концентрации продуцирующих видов (например,грамм. синтаза является продуцентом АГЛ). Доступность питательных веществ является нелинейной функцией локальной концентрации питательных веществ, определяемой функцией Хилла [11].

В то время как производство белка и производство AHL зависят от наличия питательных веществ, только рост клеток фактически потребляет питательные вещества. Эта особенность основана на предположении, что метаболические вложения в составляющие белки цепи незначительны по сравнению со всеми другими клеточными активностями. Кроме того, мы предполагаем, что деградация и диффузия белка незначительны.Это предположение подтверждается наблюдением, что образцы флуоресценции в колонии стабильны на протяжении каждого проведенного эксперимента. Полная система обыкновенных дифференциальных уравнений, определяющих модель, приведена здесь. Более того, модель построена с реалистичными параметрами и единицами для диффузии и концентрации АГЛ, включая время, но мы оставляем единицы, описывающие плотность клеток, количество белка и концентрацию питательных веществ произвольными [11].

Мы выполнили моделирование каждого эксперимента и вручную обнаружили параметры модели (таблица 1, включая начальные значения питательных веществ и плотности), которые дают поведение, подобное тому, которое мы наблюдали в экспериментах.Как и в каждом эксперименте, моделирование позволяет колониям расти в течение смоделированных 18 часов перед добавлением AHL. Ниже представлены первый и последний кадры моделирования эксперимента с полным массивом, описанного выше, первый кадр следует сразу за моделированным добавлением Cin AHL. В установке этого эксперимента два массива были засеяны на одну и ту же пластину, что также имеет место при моделировании. Мы анализируем только массив с большим разделением между колониями.

Смоделированный массив колоний показал постоянную скорость распространения сигнала, как мы обнаружили в эксперименте.Моделирование было также выполнено для проверки того, что распространение сигнала не удается, когда одна колония удаляется из массива, и что массивы с более близко расположенными колониями приводят к неплотной активации сигнальных цепей. Эти результаты моделирования подтверждают, что наша модель схемы действительна и что она позволяет in silico предсказывать более сложные схемы связи или структуры колоний.

Начальное и конечное состояния моделирования из моделирования каскадного эксперимента с полным массивом.Нижний ряд графиков показывает маски, которые определяют границы отдельных колоний интересующего сигнального массива и распределение синтазы в этих масках.

Отобранные вручную параметры модели, которые дают поведение, подобное тому, которое мы наблюдали в экспериментах. Параметры со знаком 0 в их индексе относятся к начальному состоянию моделирования, за 18 часов моделирования до начала эксперимента. C _aro , Crao — это начальные значения плотности клеток, применяемые к камерам моделирования, которые соответствуют местоположениям семян колоний. n ₀ — начальная концентрация питательных веществ, которая одинакова по всей чашке. Аналогичным образом 2,5 мМ Cin AHL добавляют в камеру для посева колонии 1 после периода роста.

В целях определения скорости передачи сигнального каскада, мы рассматриваем значение количества синтазы, чтобы представить флуоресценцию аналогичным образом экспрессируемых репортерных белков в эксперименте. Порог для смоделированных данных был установлен на нормализованное значение флуоресценции колонии, которое Колония 1 принимает через два с половиной часа после воздействия смоделированного болюса AHL, добавленного экспериментатором, но до получения AHL от ближайшего соседа.Скорость передачи при моделировании составляла 0,081 см / час, что немного выше, чем в эксперименте.

Обсуждение

В этом исследовании мы определили несколько методов настройки длины и временных масштабов межклеточной коммуникации в полутвердой среде и применили диапазон взаимодействий к массиву проводящих сигнал колоний. Наши результаты показали, что намеренное расположение колонии может привести к новому взаимодействию и распространению сигнала. Эти свойства могут быть применены для проектирования сложных смешанных сообществ в гетерогенных средах для сложных операций.

Части наших наблюдений и дизайна соответствуют наблюдениям Colisweeper, проекту 2013 ETH Zurich IGEM [1]. Colisweeper — это игра-тральщик с бактериями в агаре. Система состоит из различных колоний, расположенных в виде сот. Отдельные колонии в этой системе используют компоненты QS Luxl-LuxR, чтобы определить, являются ли соседние колонии «минами». Расстояние отклика сигнала было отмечено как 1,5 см в их предварительной характеристике диффузии отправитель-получатель, что попадает в диапазон масштабов длины, определенных в нашей системе Cinl-CinR.Colisweeper применяет это расстояние срабатывания аналогично нашему. Расстояние отклика сообщало разделение колонии на колонию в обеих моделях колоний, чтобы ограничить передачу сигналов за пределы соседних колоний, и, таким образом, обе системы включают намеренное пространственное размещение в конструкции многоклеточных систем.

Наше исследование расширяет предыдущие исследования двумя способами. Во-первых, деградаза AHL обычно используется для отрицательной обратной связи в генетических цепях [8, 9], но здесь мы показали, что экспрессия деградазы AHL может генерировать задержку сигнала и пороговый эффект, а также влиять на клетки в локальной области.Такое поведение расширяет диапазон свойств, которые можно применить к новой системе формирования паттернов. Например, деградаза AHL может стабилизировать выключенное состояние в бистабильной системе положительной обратной связи в полутвердой среде. Во-вторых, мы успешно сконструировали колонии, способные передавать сигнал, в то время как колонии в Colisweeper способны либо излучать сигнал («мины»), либо обнаруживать («не мины») [1]. Эти колонии передатчиков и успешная демонстрация распространения сигнала подтверждают, что можно сформировать более сложную коммуникационную сеть на основе колоний.В такой сети колонии-передатчики могут действовать как сотовые «провода» для соединения колоний с различными функциями, распределенных в определенном пространстве. Примером может служить микробный консорциум, который саморегулирует относительную популяцию неравномерно распределенных подсообществ.

Ограниченная сложность синтетических биологических операций остается центральной проблемой в области синтетической биологии, и для ее решения разрабатываются различные инструменты и методы [14]. Многие потенциальные решения этой проблемы относятся к продвижению ортогональных частей или подсистем, обе из которых улучшают модульность с целью увеличения сложности [2, 6].В этом исследовании мы используем несколько типов клеток и пространственное разделение в гетерогенных средах для достижения разделения. Эти стратегии предоставляют возможность выполнять сложные биологические операции в смешанном сообществе сконструированных клеток, живущих в гетерогенной среде.

Материалы и методы

Конструирование контуров и штаммов

Гены, использованные в этом исследовании, были клонированы системой Golden Gate Assembly [10] с использованием конститутивного промотора (J23106), сайтов связывания рибосом (B0034, B0032, B0033), репортерных кодирующих последовательностей. (GFP, RFP) и терминатор (B0015) из набора CIDAR Moclo Parts Kit [10] и гибридные промоторы QS (pRhlLacO, pCinTetO) и кодирующие последовательности (AiiA, rhll, cinl) от Chen et al [8].

Для сигнальных цепей в исследовании длины и времени, передающие цепи экспрессировали Cinl AHL-синтазу под контролем изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG), который был добавлен в чашки с агаром LB. Цепи приемника конститутивно экспрессировали фактор транскрипции CinR и GFP под контролем активированного Cin промотора. Ген конститутивной деградазы AHL (AiiA) был локализован на отдельной плазмиде и котрансформирован вместе с приемной цепью для экспрессирующего деградазу приемного штамма.DH5α-zl и MG1655-zl использовали для штаммов-отправителей, в то время как обычные DH5α и MG1655 использовали для штаммов-получателей.

Каждая сигнальная цепь в коммуникационном массиве состоит из двух генов, которые были клонированы в одну и ту же плазмиду с помощью сборки Гибсона. Одна цепь экспрессирует Rhll и GFP от отдельного активированного Cin промотора, а другая экспрессирует Cin1 и RFP от отдельного активированного Rh1 промотора. Каждая цепь была трансформирована в штамм CY026, который конститутивно экспрессирует факторы транскрипции CinR и RhIR из генома [8].

Покрытие и запись стереоскопа

Пространственные узоры были спланированы в шаблоне Excel в соответствии с сеткой из 1536 пластин. Посевные культуры разводили из разрастаний ночных культур LB до 0,5 или 0,35 OD600. 25 нл жидкой культуры высевали на LB-агар OmniTrays для каждого обозначенного положения с использованием Echo 525 Liquid Handler. Кроме того, в эксперименте с задержкой сигнала, показанном на фиг. 5, полоски агара шириной в 1 лунку между парами колоний физически вырезали и удаляли сразу после посева, чтобы сформировать изолированные блоки агаровой среды для каждой пары колоний.Все засеянные OmniTrays агара LB инкубировали в течение ночи при 37 ° C. 25 нл 2,5 мМ индуктора Cin AHL добавляли к колонии 1 коммуникационного массива на следующее утро с использованием Echo 525 Liquid Handler. После этого чашки с агаром хранили при комнатной температуре. Изображения планшетов получали с помощью микроскопа Olympus MVX10 в каналах RFP и GFP каждые 5–12 часов. Фильмы для подмножества пластинок снимались с 5-минутным интервалом от 12 до 70 часов.

Благодарности

Мы благодарим Андрея Шура за техническую помощь с микроскопом, Шан Хуанга за предоставление E.coli stock и других участников Murray Lab за полезные обсуждения. Джой Дун был поддержан программой Amgen Scholar Program, а Джеймс М. Паркин получил поддержку Института совместных биотехнологий через грант W911NF-09-0001 от Исследовательского управления армии США. Содержание информации не обязательно отражает позицию или политику правительства, и не следует делать вывод об официальном одобрении. Плазмидные векторы и некодирующие области были предоставлены Дугласом Денсмором из лаборатории междисциплинарной интеграции исследовательской лаборатории автоматизации проектирования (Addgene Kit # 1000000059).Промоторы, воспринимающие кворум, кодирующие последовательности и штамм CY026 были предоставлены Мэтью Беннеттом (Addgene Plasmid # 65954, 65952, 72340).

Ссылки

1. ↵
2. ↵
3. ↵
4. ↵
5. ↵
6. ↵

   JM Callura, CR Cantor и JJ Collins, «Генетический коммутатор для приложений синтетической биологии», Труды Национальной академии наук , т. 109, pp. 5850–5855, 2012.

7. ↵
8. ↵
9. ↵
10. ↵
11. ↵
12. ↵
13. ↵
14. ↵
15. ↵

16. Шоу, С. Рам и Дж. М. Г. Вилар, «Синтетическое сотрудничество в сконструированных популяциях дрожжей», Труды Национальной Академии Наук, том. 104, pp. 1877–1882, 6 февраля 2007 г. 2007.

17. ↵
18. ↵
19. ↵

Genetic Circuit — обзор

23.2.3.2 Oscillator Network

В качестве второго примера, генетическая схема проиллюстрирована реализация генератора. Эта схема называется repressilator и является одной из вех синтетической биологии, появившейся в статье 2000 г. [33].В то время как целью предыдущего примера было описание и повторное использование функции генетической логики, здесь цель состоит в том, чтобы описать инструменты моделирования для разработки сложной схемы с первых шагов. На рисунке 23.3 показана структура схемы. Вкратце, он состоит из трех репрессорных генов и трех репрессируемых промоторов: первый репрессорный белок (LacI) ингибирует транскрипцию второго репрессорного гена (tetR), белковый продукт которого (TetR), в свою очередь, ингибирует экспрессию третьего гена (cI ).Наконец, его белковый продукт (CI) подавляет экспрессию lacI, завершая цикл. Эта отрицательная обратная связь, по существу, вызванная тремя логическими инверторами, приводит к временным колебаниям уровней мРНК и белка.

Рисунок 23.3. Биологическая колебательная сеть. Схема состоит из трех соединенных между собой вентилей НЕ с обратной связью, что позволяет получить кольцевой генератор. Все виды, участвующие в системе (т. Е. Концентрации мРНК и белка), могут колебаться при правильной настройке регуляторных элементов.

Простая модель регуляции транскрипции была использована Elowitz и Leibler [33] для разработки устройства: динамика транскрипции и трансляции может быть выражена как в уравнениях. (23.1) и (23.2), и предполагается, что репрессия промотора следует функции Хилла, как в уравнениях. (23.8) и (23.9).

На ранних этапах разработки репрессилятора основная цель — оценить in silico , может ли такая генетическая конфигурация проявлять колебания своих элементов. По этой причине анализ модели может выполняться на безразмерных уравнениях, используя разумные значения параметров для численного моделирования системы и определения параметров, оказывающих большое влияние на колебательное поведение.Безразмерные уравнения:

(23,22) dmidt = α0i + αi1 + pjni − mi

(23,23) dpidt = βi · (mi − pi)

(i = lacI, tetR, cIj = cI, lacI, tetR)

где m и p — уровни мРНК и белка, пересчитанные на скорость трансляции ( ρ ) и 1/ K , соответственно; α — максимальная активность промотора, а α 0 — его основная активность; время пересчитывается на скорость деградации мРНК; n — коэффициент Хилла; и, наконец, β — это соотношение скорости деградации белка и скорости деградации мРНК.Описанная модель была изучена в симметричной структуре, где количества и параметры ( α , β , α 0 и n ) трех репрессоров идентичны, за исключением специфичности по отношению к их соответствующему промотору.

Включение уравнений транскрипции необходимо для получения колебательного поведения схемы, поскольку колебания могут возникать только тогда, когда производство белка задерживается (например, из-за динамики транскрипции). В противном случае анализ модели показывает, что нет значения параметра, совместимого с автоколебаниями.

Точки равновесия модели ODE можно вычислить, установив производные по времени равными нулю. Поскольку p / α и 1 / (1+ p ⁿ ) имеют только одно пересечение, система имеет одну точку равновесия p * , решение p * = α 0+ α / (1+ p * ⁿ ). Устойчивость точки равновесия можно изучить, линеаризуя систему уравнений:

(23.24) dδmidt = −δmi − α · n · pjn − 1 (1 + pjn) 2 | p * · δpj

(23,25) dδpidt = β · δmi − β · δpi

, где δ указывает на изменение переменная состояния от точки равновесия p *. Полная линеаризованная система имеет вид:

(23,26) dδydt = A · δy

, где δ y — вектор-столбец переменных состояния линеаризованной системы [ δm ₁ δp ₁ δm ₂ δp ₂ δm ₃ δp ₃ ] ^T .Из матрицы 6 × 6 A можно исследовать границы устойчивости системы, совместимые с колебаниями, в зависимости от параметров модели. В частности, точка равновесия не должна быть асимптотически устойчивой, чтобы быть совместимой с желаемым колебательным поведением, поэтому по крайней мере одно собственное значение A должно иметь положительную действительную часть. Вкратце, получив собственные значения A , можно найти выражение, которое описывает граничную кривую, разделяющую области, где могут существовать положительные собственные значения действительной части:

(23.27) (β + 1) 2β = 3 · X24 + 2 · X

, где

(23,28) X = −α · n · pn − 1 (1 + pn) 2

Это выражение является функцией всех параметры модели, и это позволяет идентифицировать критические параметры и значения, которые позволяют системе, возможно, показывать колебательное поведение. Все параметры имеют решающее значение для получения точки неустойчивого равновесия (рис. 23.4): требуются высокие значения α , β и n , а также низкое соотношение α ₀ / α . .Такие характеристики соответствуют сильным промоторам с низкой основной активностью и высокой кооперативностью, тогда как белки должны иметь высокую скорость распада (для фиксированной скорости распада мРНК). В частности, при β , n и α ₀ точка равновесия не может быть нестабильной для значений α ниже определенного порога. Область нестабильности становится больше при увеличении значений n : сравнивая кривые A и B , можно увидеть, что небольшое увеличение (с 2 до 2.1) значения n приводит к гораздо большей нестабильной области, так что скорость распада белка становится менее важной при проектировании колебательного поведения.

Рисунок 23.4. Диаграмма устойчивости модели репрессилятора. Граничные кривые разделяют области, где могут существовать положительные собственные значения действительной части для трех различных конфигураций параметров. A – C соответствуют граничным кривым для различных значений параметров: A, n = 2,1, α ₀ = 0; B, n = 2, α ₀ = 0; C, n = 2, α ₀ / α = 10 ⁻³ .Заштрихованная область соответствует нестабильному участку кривой A.

Это исследование подчеркивает важность математического моделирования в синтетической биологии для поддержки дизайна искусственной функции, поведение которой было нетривиально предсказать как функцию задействованных параметров.