Ку икс 70: 70 : Infiniti QX70 , .

В продаже оригинальные запасные части и их аналоги на INFINITI QX80. Полная информация о характеристиках авто деталей, в том числе размеры и применимость в авто. Подбор по VIN коду (номеру кузова) автомобиля.

Каталог оригинальных запчастей на INFINITI QX80 и их аналогов

Доступные модификации INFINITI QX80 (Инфинити Ку икс 80)

• 5.6

  2013 — настоящее время

  внедорожник

  5. 6 л. , бензин

  405 л.с. 298 кВт

  Код двигателя : VK56VD

• 5.6 AWD

  2013 — настоящее время

  внедорожник

  5.6 л. , бензин

  405 л. с. 298 кВт

  Код двигателя : VK56VD

• 5.6 AWD

  2013 — настоящее время

  внедорожник

  5.6 л. , бензин

  400 л.с. 294 кВт

  Код двигателя : VK56VD

• 6″> 5.6 D AWD

  2013 — настоящее время

  внедорожник

  5.6 л. , бензин

  441 л.с. 324 кВт

В продаже есть запасные части на другие модели INFINITI

XRCC6 Рентгеновский ремонт перекрестного комплемента 6 [Homo sapiens (человек)] — Ген

НОВЫЙ Попробуйте новую таблицу расшифровок

RefSeqs поддерживается независимо от аннотированных Геномы

Эти эталонные последовательности существуют независимо от построения генома. Объясните

Эти эталонные последовательности курируются независимо от генома. цикл аннотаций, поэтому их версии могут не совпадать с версиями RefSeq в текущем построение генома.Определите несоответствие версий, сравнив версию RefSeq в этот раздел к разделу, указанному в геномных регионах, стенограммы и продукты, указанные выше.

мРНК и белок (белки)

1. NM_001288976.2 → NP_001275905.1 Рентгеновская репарация перекрестно комплементарная изоформа 1 белка 6

   См. Идентичные белки и их аннотированные местоположения для NP_001275905.1

   Статус: ПЕРЕСМОТРЕН

   Описание

   Вариант транскрипции: этот вариант (2) отличается 5 ‘UTR по сравнению с вариантом 1.Варианты 1 и 2 кодируют один и тот же белок (изоформа 1).

   Исходная последовательность (и)

   BC001583, BU3, DA647513, DA718140, DC383335, Z83840

   Консенсус CDS

   CCDS14021. 1

   UniProtKB / Swiss-Prot

   P12956

   UniProtKB / TrEMBL

   A0A024R1N4

   Связанные

   ENSP00000352257.4, ENST00000359308.8

   Консервированные домены (1) сводка

   TIGR00578
   Расположение: 26 → 608

   ку70; АТФ-зависимая ДНК-геликаза II, субъединица 70 кДа (ku70)

2. NM_001288977.2 → NP_001275906.1 Рентгеновская репарация перекрестно комплементарная изоформа 2 белка 6

   См. Идентичные белки и их аннотированные местоположения для NP_001275906.1

   Статус: ПЕРЕСМОТРЕН

   Описание

   Вариант транскрипции

   : В этом варианте (3) используется альтернативный сайт сплайсинга в рамке в 5′-кодирующей области. Кодируемый белок (изоформа 2) короче по сравнению с изоформой 1.

   Исходная последовательность (и)

   AK055786, BQ217843, BU584415, BU751953

   Консенсус CDS

   CCDS74870.1

   UniProtKB / Swiss-Prot

   P12956

   Связанные

   ENSP00000384941.3, ENST00000402580.7

   Консервированные домены (1) сводка

   TIGR00578
   Расположение: 26 → 567

   ку70; АТФ-зависимая ДНК-геликаза II, субъединица 70 кДа (ku70)

3. NM_001288978.2 → NP_001275907.1 Изоформа 3 белка 6, перекрестно комплементарная при рентгеновской репарации,

   Статус: ПЕРЕСМОТРЕН

   Описание

   Вариант транскрипта

   : в этом варианте (4) отсутствует альтернативный экзон в рамке считывания и используется нисходящий старт трансляции по сравнению с вариантом 1. Кодируемый белок (изоформа 3) имеет более короткий N-конец по сравнению с изоформой 1.

   Исходная последовательность (и)

   AK293439, AK304580, BI222708, BU751953, Z83840

   Консенсус CDS

   CCDS74871.1

   UniProtKB / TrEMBL

   B1AHC9, B4DE32, B4E356

   Связанные

   ENSP00000403679.3, ENST00000428575.6

   Консервированные домены (1) сводка

   TIGR00578
   Расположение: 16 → 558

   ку70; АТФ-зависимая ДНК-геликаза II, субъединица 70 кДа (ku70)

4. NM_001469.5 → NP_001460.1 Изоформа 1 белка 6, перекрестно комплементарная при рентгеновской репарации,

   См. Идентичные белки и их аннотированные местоположения для NP_001460. 1

   Статус: ПЕРЕСМОТРЕН

   Описание

   Вариант транскрипта

   : этот вариант (1) представляет самый длинный транскрипт и кодирует самый длинный белок (изоформа 1). Варианты 1 и 2 кодируют один и тот же белок.

   Исходная последовательность (и)

   AK055786, BC012154, BC018259

   Консенсус CDS

   CCDS14021.1

   UniProtKB / Swiss-Prot

   P12956

   UniProtKB / TrEMBL

   A0A024R1N4

   Связанные

   ENSP00000353192.3, ENST00000360079.8

   Консервированные домены (1) сводка

   TIGR00578
   Расположение: 26 → 608

   ку70; АТФ-зависимая ДНК-геликаза II, субъединица 70 кДа (ku70)

RefSeqs of Annotated Genomes: Homo sapiens Обновленная аннотация, выпуск 109.

Следующие разделы содержат ссылочные последовательности, принадлежащие специфическая конструкция генома. Объясните

Этот раздел включает геномную ссылку Последовательности (RefSeqs) из всех сборок, на которых аннотирован этот ген, например RefSeqs для хромосом и каркасов (контигов) как из эталонных, так и из альтернативных сборки. Здесь также представлены модельные РНК и белки.

Ссылка ГРЧ48.p13 Первичная сборка

Геномный

1. NC_000022.11 Ссылка ГРЧ48.р13 Первичная сборка

   Диапазон

   41621295..41664041

   Скачать

   GenBank, FASTA, Sequence Viewer (графика)

Ku70 необходим для позднего развития В-клеток и переключения классов тяжелых цепей иммуноглобулинов

Рекомбинация с переключением класса тяжелой цепи (HC) иммуноглобулина (Ig) — это поздний процесс B-клеток, который включает внутрихромосомную перестройку ДНК. Ku70 и Ku80 образуют комплекс, связывающий конец ДНК, необходимый для репарации двухцепочечных разрывов ДНК и рекомбинации V (D) J. У мышей Ku70 (- / -) (K70T), как и у мышей с геном активации рекомбинации (RAG) -1 или с дефицитом RAG-2 (R1T или R2T), нарушено развитие B- и T-клеток на ранней стадии предшественников, что считается по крайней мере частично в результате дефектной рекомбинации V (D) J (Gu, Y., KJ Seidl, GA Rathbun, C. Zhu, JP Manis, N. van der Stoep, L. Davidson, HL Cheng, JM Sekiguchi, K Франк и др. 1997.Иммунитет. 7: 653-665; Оуян, Х., А. Нуссенцвейг, А. Куримаса, В. Соареш, X. Ли, К. Кордон-Кардо, В. Ли, Н. Чеонг, М. Нуссенцвейг, Г. Илиакис и др. 1997. J. Exp. Med. 186: 921-929). Поэтому, чтобы изучить потенциальную роль Ku70 в CSR, мы создали мышей K70T, которые несут локус HC зародышевой линии, в котором область JH была заменена функционально перестроенным трансгеном VH (D) JH и легкой цепи лямбда Ig (обозначается как K70T. / HL мышей). Ранее мы показали, что В-клетки от мышей R1T или R2T, несущих эти перестроенные гены Ig (мыши R1T / HL или R2T / HL), могут подвергаться CSR к изотипам IgG (Lansford, R. , J. Manis, E. Sonoda, K. Rajewsky, F. Alt. 1998. Int. Иммунол. 10: 325-332). Мыши K70T / HL имели значительное количество периферических поверхностных IgM + B-клеток, которые генерировали уровни IgM в сыворотке, аналогичные уровням мышей R2T / HL. Однако, в отличие от мышей R2T / HL, у мышей K70T / HL не было обнаруживаемых изотипов сывороточного IgG. Культивирование in vitro B-клеток K70T / HL с агентами, которые индуцируют CSR в нормальных B-клетках или R2T / HL, действительно приводило к индукции транскриптов CH зародышевой линии, что указывает на то, что исходные сигнальные пути для CSR были интактными в клетках K70T / HL.Однако лечение такими агентами не привело к обнаружению CSR B-клетками K70T / HL, а вместо этого привело к гибели клеток в течение 72 часов. Мы пришли к выводу, что Ku70 необходим для генерации В-клеток, которые претерпели переключение класса Ig HC. Обсуждаются потенциальные роли Ku70 в процессе CSR.

Ku с помощью малой интерферирующей РНК Ku70 усиливает ответ раковых клеток человека на ингибитор топоизомеразы II и гамма-излучение

Abstract

Белок Ku представляет собой гетеродимер (Ku70 и Ku86), который, как известно, играет важную роль в рекомбинации V (D) J, апоптоз, слияние теломер и восстановление двухцепочечных разрывов. Его роль в двухцепочечных разрывах имеет отношение к терапии рака, потому что недостаток Ku86 вызывает один из наиболее чувствительных к облучению фенотипов (клетки хомяка, XRS5). Хотя известно, что гетеродимер необходим для различных функций этого белка, влияние нацеливания Ku на раковые клетки человека не было продемонстрировано из-за отсутствия подходящих подходов. Также неизвестно, требуется ли полный нокаут белка Ku для повышения чувствительности клеток человека к γ-излучению, поскольку белок Ku гораздо более распространен в клетках человека, чем в клетках хомяка.В данной статье мы исследовали прямой эффект истощения Ku70 в клетках эпителиоида шейки матки (HeLa) и карциномы толстой кишки (HCT116) человека. Мы специально нацелены на мРНК Ku70 с помощью малой интерферирующей РНК (миРНК). Из пяти синтезированных миРНК Ku70 три ингибировали экспрессию Ku70 до 70% в клетках HeLa. Мы проверили влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 (CS # 5) на реакцию клеток HeLa через 72 часа после трансфекции на γ-излучение и этопозид, поскольку это показало максимальное ингибирование экспрессии Ku70. Ku70 siRNA вызывала уменьшение выживающей фракции облученных клеток HeLa в несколько раз. Аналогичные сенсибилизирующие эффекты наблюдались для этопозида, ингибитора топоизомеразы II. Исследования клеток HCT116 с использованием той же миРНК Ku70 (CS # 5) показали прямую корреляцию между экспрессией Ku70 и сенсибилизацией к облучению и лечению этопозидом.

• Молекулярные мишени радиационного ответа
• Подавление и реактивация экспрессии генов

Введение

Целевые белки, ответственные за устойчивость раковых клеток к гамма-излучению и химиотерапевтическим агентам, уже давно вызывают интерес (1 –4).Самые последние молекулярно-биологические исследования были сосредоточены на механизмах передачи сигналов, ответственных за клеточную пролиферацию и рост (4-7). Вполне возможно, что нацеливание на сигнальные пути, опосредованные фосфорилированием, киназами, рецепторами роста и онкогенами, может дать клинически значимые подходы для специфического уничтожения раковых клеток; при условии, что только раковые клетки, а не нормальные клетки, полагаются на эти пути для выживания. Имеются многочисленные доклинические доказательства того, что эти ингибиторы могут усиливать противоопухолевые эффекты многих цитотоксических агентов (8).Однако эффективность этих ингибиторов для усиления эффектов цитотоксических агентов в клинических исследованиях на людях четко не установлена ​​(8). Baker et al. (9) показали, что сверхэкспрессия тиоредоксина, который играет определенную роль в росте нескольких раковых клеток, эффективна для снижения чувствительности клеток млекопитающих к определенным химиотерапевтическим агентам. Однако недавно мы показали, что ингибирование окислительного пентозофосфатного цикла, который поставляет НАДФН, необходимый для функции тиоредоксина и других белков, не сенсибилизирует доброкачественные клетки яичника китайского хомячка к этопозиду, ³ и лишь незначительно сенсибилизирует эти клетки к нему. γ-излучение (10).Эти результаты показали, что окислительно-восстановительный цикл, опосредованный пентозофосфатным циклом, может играть лишь незначительную роль в клеточном ответе на агенты, повреждающие ДНК. Наиболее важные нисходящие сигнальные пути, которые могут играть важную роль в сенсибилизации раковых клеток к агентам, повреждающим ДНК, — это пути, участвующие в апоптозе (11-13). Ранее мы показали, что ДНК является важной мишенью при радиационно-индуцированном апоптозе, предполагая, что как митотическая, так и апоптотическая гибель клеток вызываются повреждениями ДНК после облучения (14).

Ku-белок играет важную роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, вызванных гамма-излучением и некоторыми химиотерапевтическими агентами (15–19). Ключевой системой репарации двухцепочечных разрывов ДНК является негомологичное соединение концов (20, 21). Роль Ku — связываться с концами ДНК, облегчая координацию других белков репарации ДНК (20, 21). Биохимические и генетические исследования с использованием мутантных клеточных линий грызунов, чувствительных к ионизирующему излучению, идентифицировали по крайней мере четыре гена, XRCC4, XRCC5, XRCC6 и XRCC7, которые необходимы для негомологичного соединения концов (20, 21). XRCC4 кодирует ядерный фосфопротеин 38 кДа, который прочно связывается с ДНК-лигазой IV (21). XRCC7 кодирует каталитическую субъединицу 460 кДа (DNA-PKcs) ДНК-PK (20, 21). XRCC5 и XRCC6 кодируют субъединицы 86 и 70 кДа, соответственно, аутоантигена Ku, белка, связывающего конец ДНК, и регуляторной субъединицы DNA-PK (20, 21). Считается, что протеинкиназная активность DNA-PK стимулируется его ассоциацией с Ku, связанным с концом ДНК (20, 21). Гетеродимер Ku связывается с концами ДНК не зависимым от последовательности образом (20, 21).Для ДНК-связывающей активности Ku необходимы восстановленные сульфгидрильные группы в бесклеточных системах (22). Гетеродимер Ku содержит 14 остатков цистеина, 5 из которых расположены в Ku70, который находится в контакте с сайтом связывания ДНК (22). В недавнем отчете мы показали, что функция белка Ku может быть значительно снижена в клетках яичника китайского хомячка с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы за счет окисления тиола Ku-белка (23). Однако этот биохимический подход эффективен только для клеток с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В этом исследовании мы использовали новый молекулярный подход для специфической нацеливания мРНК Ku70. Мы показываем, что этот подход подавляет экспрессию белка Ku70 и вызывает повышенный ответ раковых клеток на γ-излучение и ингибитор топоизомеразы II.

Материалы и методы

Клетки и питательная среда

Раковые клетки HeLa и HCT116 были получены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния). Эти клетки выращивали в среде McCoy 5A с 10% FCS и 20 ммоль / л HEPES при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ .

Ku70 Синтез малых интерферирующих РНК

In vitro – транскрибируемая миРНК. Нуклеотидная последовательность гена Ku человека (номер доступа BC010034) была получена из Национального центра биотехнологической информации. Двадцать один-мерный нуклеотид с исходными аминокислотными нуклеотидами для нескольких целевых последовательностей были отобраны с использованием программного обеспечения Ambion. Для получения in vitro транскрибируемой малой интерферирующей РНК (siRNA) против Ku70 мы использовали конструктор pSilencer siRNA в соответствии с рекомендациями производителя (Ambion, Austin, TX).Смысловой и антисмысловой для двух последовательностей-мишеней Ku70-3 и Ku70-4 для in vitro, транскрибируемой миРНК, показаны ниже: и

Эти олигонуклеотиды гибридизовали с промоторным праймером Т7, поставляемым в наборе производителя, и использовали в соответствии с указаниями.

Химически синтезированная миРНК. Мы также получили миРНК путем химического синтеза на предприятии по синтезу олигонуклеотидов миРНК компании Ambion. Мы использовали следующие смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды для последовательностей-мишеней Ku70-3, Ku70-4 и Ku70-5 для получения химически синтезированной миРНК против Ku70.

• (a) миРНК для Ku70-3 состоит из гибридизированных смысловых 5′-UUCAGGUGACUCCUCCAGGTT-3 ‘и антисмысловых 5′-CCUGGAGGAGUCACCUGAATT-3’ олигонуклеотидов.

• (b) миРНК для Ku70-4 состоит из гибридизированных смысловых 5′-UUCUCUUGGUAACUUUCCCTT-3 ‘и антисмысловых 5′-GGGAAAGUUACCAAGAGAATT-3’ олигонуклеотидов.

• (c) миРНК для Ku70-5 состоит из гибридизированных смысловых 5′-GAUGCCCUUUACUGAAAAATT-3 ‘и антисмысловых 5′-UUUUUCAGUAAAGGGCAUCTT-3’ олигонуклеотидов.

Генерированная РНКаза III. Мы также создали миРНК путем ферментативного расщепления длинной in vitro -транскрибируемой двухцепочечной молекулы РНК бактериальным ферментом РНКазой III. Ферментативное расщепление дает двухцепочечные миРНК, соответствующие нескольким различным последовательностям-мишеням. Ожидается, что смесь нескольких разных миРНК, нацеленных на разные последовательности-мишени в гене, будет эффективной в большинстве клеток. Чтобы получить длинную двухцепочечную РНК Ku70, мы сначала амплифицировали область Ku70 размером ~ 200 п.н. с использованием праймеров 5′-AATTTAATACGACTCACTATAGGCTATGGTACCGAGAAAGACA-3 ‘и 5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGCTAAAGAGGGTTGGCACAGGAC, полученных из клеток, комплементарных TTGGCACAGGAC. ПЦР-продукт 200 пар оснований обрабатывали на 1% агарозном геле и очищали. Затем были получены длинная двухцепочечная РНК и миРНК в соответствии с инструкциями из набора для коктейлей миРНК (Ambion).

siRNA # 1 от Ambion (каталог № 4850) использовали в этих исследованиях в качестве отрицательного контроля.

Ku70 siRNA Transfection

Сорок тысяч клеток HeLa или HCT116 в общем объеме 370 мкл среды McCoy 5A помещали в 24-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Среду McCoy 5A аспирировали, и клетки промывали сбалансированным солевым раствором Эрла с 20 ммоль / л HEPES.В клетки добавляли 200 мкл свежей среды DMEM и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ . Клетки обрабатывали миРНК Ku70 или скремблированной миРНК в качестве отрицательного контроля в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, миРНК и олигофектамин смешивали отдельно с OptiMem и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Эти реагенты объединяли и инкубировали еще 15 минут перед добавлением к клеткам в среде DMEM без пенициллина и стрептомицина.Влияние миРНК Ku70 на белок Ku70 определяли вестерн-блоттингом через 24, 48 и 72 часа после трансфекции. Эффекты гамма-излучения и ядов топоизомеразы II на клетки HeLa оценивали через 72 часа после трансфекции миРНК Ku70, поскольку 72-часовая инкубация с миРНК показала максимальное ингибирование экспрессии Ku70. Эффекты гамма-излучения и ядов топоизомеразы II на клетки HCT116 оценивали через 24, 48 и 72 часа после трансфекции миРНК Ku70, чтобы определить, существует ли прямая корреляция между экспрессией Ku70 и сенсибилизацией к радиации и этопозиду.

Вестерн-блот-анализ

Общее количество клеточного белка Ku70 определяли количественно с помощью вестерн-блоттинга и анализа изображений NIH. Раковые клетки HeLa и HCT116, обработанные миРНК Ku70 и без них, трижды промывали PBS и смешивали с 200 мкл лизирующего буфера [20 ммоль / л Трис (pH 7,6), 150 ммоль / л NaCl, 2 ммоль / л EDTA, 10% глицерин. , 1% Triton X-100, 1 ммоль / л DTT, 1 ммоль / л ортованадат, 2 ммоль / л фенилметилсульфонилфторид], содержащий 6 мкл коктейля ингибиторов протеаз (Sigma, St.Louis, MO) и 6 мкл восстанавливающего агента NuPAGE. Клетки в буфере для лизиса в чашке удаляли с помощью тефлонового скребка и переносили в пробирку Эппендорфа с помощью микропипетки. Клетки гомогенизировали с использованием шприца на 1 мл (игла 22 размера), центрифугировали при 6000 × g в течение 2 минут в микроцентрифуге (Fisher 59A) и супернатант хранили при -80 ° C. Белковые экстракты (10 мкг) инкубировали в буфере для образцов NuPAGE, содержащем 4 мкл восстанавливающего агента NuPAGE, при 70 ° C в течение 10 минут. Затем эти образцы подвергали электрофорезу в 10% -ном геле Bis / Tris от NuPAGE при 200 В в течение 60 минут в рабочем буфере MOPS SDS (NuPAGE).Белки переносили на нитроцеллюлозу электрофорезом в буфере для переноса NuPAGE при 20 В в течение 60 минут. Нитроцеллюлозный блот инкубировали с 10 мл блокирующего буфера в течение 1,5 часов при комнатной температуре на качалке и хранили в холодной комнате в течение ночи. Нитроцеллюлозную бумагу промывали пять раз PBS, содержащим 0,1% Tween 20 (PBST), а затем инкубировали с 20 мкл первичного антитела Ku (p70) (Ab-4, клон N3h20, Neomarkers, Fremont, CA) в 10 мл блокирующего буфера. в течение 2 часов при комнатной температуре.Нитроцеллюлозную бумагу промывали пять раз PBST перед инкубацией с вторичным мышиным антителом, меченным пероксидазой, в течение 1 часа, в соответствии с инструкциями производителя (Amersham, Piscataway, NJ), и полосы детектировали с использованием стандартного набора для усиленной хемилюминесценции. Плотность полос в полученной пленке была определена количественно с использованием анализа изображений NIH.

Иммунофлуоресценция и визуализация

Иммунофлуоресцентный анализ выполняли следующим образом: сначала в указанное время после трансфекции в 24-луночной чашке для тканевых культур клетки фиксировали 5-минутной инкубацией в свежем 4% параформальдегиде / PBS при комнатной температуре. .Клетки промывали 1 мл 1 × PBS, повышали проницаемость путем добавления 0,1% Triton X-100 / PBS и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем клетки промывали 1 × PBS, блокировали 3% BSA / PBS в течение 1 часа и промывали 1 × PBS. Первичное антитело Ku70 (Ambion, № по каталогу 4320) разводили 1: 200 в PBS, смешивали с клетками и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем первичное антитело удаляли, клетки промывали 1 мл PBS и инкубировали в течение 1 часа со вторичным антителом (FITC-конъюгированный Affinity-Pure ослиный антимышиный IgG, каталог № 715-095-150, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) с последующей промывкой PBS и закреплением с помощью VectaShield с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (Vector Labs, h2200).Клетки визуализировали с помощью микроскопа Olympus BX60 и количественно оценивали с помощью Metamorph.

Облучение или обработка этопозидом

Клетки в 24-луночных планшетах облучали при комнатной температуре на воздухе с использованием облучателя Shepherd Mark I ¹³⁷ Cs. Дозы облучения указаны на рисунках. В качестве альтернативы их инкубировали с различными концентрациями этопозида (Sigma) в течение 1 часа при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ .

Клоногенный анализ

Клетки в 24-луночных планшетах дважды промывали 0.3 мл PBS и трипсинизировали 0,1 мл трипсина. Трипсинизированные клетки ресуспендировали в 0,2-0,3 мл среды и 0,1 мл переносили в 12 мл среды и изотонический раствор для посева и подсчета клеток (счетчик Коултера) соответственно. Клетки высевали на чашки диаметром 100 мм при необходимой концентрации, чтобы получить не более 250 колоний на чашку. Клетки культивировали в течение 8-10 дней в 5% CO ₂ для получения жизнеспособных колоний. Жизнеспособная колония определялась как имеющая не менее 50 клеток после 10 дней роста.Выжившую фракцию обработанных клеток нормализовали по эффективности посева контрольных (необработанных) клеток.

Результаты

Чтобы определить влияние различных миРНК на экспрессию белка Ku, мы измерили количество Ku70 с помощью вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител против Ku70. Очень небольшое изменение в одной иммунореактивной полосе ~ 70 кДа наблюдалось в общих клеточных лизатах, экстрагированных из линий клеток HeLa, обработанных в течение 24 часов последовательностями-мишенями 4 ( дорожки 4 и 6 ) и 5 ​​( дорожка 7 ) и РНКаза III генерировала миРНК Ku70 ( дорожка 8, ) (рис. 1). Уровень Ku-белка дополнительно снижался после 48 и 72 часов инкубации с миРНК, причем наибольшее снижение наблюдалось через 72 часа. Кроме того, in vitro -транскрибируемая миРНК для целевой последовательности 3 ( дорожка 3 ) также показала значительное снижение, когда клетки обрабатывали миРНК в течение 48 и 72 часов. Это указывает на то, что для максимального ингибирования белка Ku70 требуется от 48 до 72 часов. Клетки HeLa, обработанные скремблированной миРНК ( дорожка 2, ), не оказали заметного влияния на уровни Ku70.Эту миРНК использовали в качестве отрицательного контроля для экспериментов, в которых определяли сенсибилизирующее действие миРНК Ku70. Из пяти миРНК Ku70 последовательности-мишени 4 ( дорожки 4 и 6 ) и 5 ​​( дорожка 7 ) являются наиболее эффективными в подавлении экспрессии Ku70. Генерированная РНКазой III миРНК Ku70 ( дорожка 8, ) ингибировала экспрессию Ku70 менее эффективно, чем миРНК Ku70, генерируемая для целевых последовательностей 3, 4 и 5.

Влияние различных миРНК на экспрессию Ku70, измеренное с помощью Вестерн-блоттинг с использованием моноклонального антитела против Ku70 в клетках HeLa. A, Вестерн-блоттинг экстрактов клеточных белков клеток HeLa через 24, 48 и 72 часа после трансфекции миРНК Ku70. Необработанный контроль ( дорожка 1, ), миРНК отрицательного контроля ( дорожка 2, ), in vitro, — транскрибированная миРНК Ku70 для целевой последовательности № 3 ( дорожка 3, ), in vitro, — транскрибированная миРНК Ku70 для целевой последовательности. # 4 ( дорожка 4, ), химически синтезированная миРНК Ku70 для целевой последовательности # 3 ( дорожка 5, ), химически синтезированная миРНК Ku70 для целевой последовательности # 4 ( дорожка 6, ), химически синтезированная миРНК Ku70 для целевой последовательности # 5 ( дорожка 7, ), и РНКаза III генерировала миРНК Ku70 ( дорожка 8, ). B, — график эффектов siRNA на общий белок Ku, количественно оцененный с помощью анализа изображения NIH, график каждой дорожки в геле и представлен как процент от необработанного контроля. Каждый эксперимент повторяли, по крайней мере, трижды с SD, как показано, если только точки не меньше нанесенных на график. Актин, контролирующий загрузку, не показал существенной разницы в загрузке.

Мы также определили экспрессию белка Ku70 с помощью иммуногистохимии в клетках, трансфицированных химически синтезированной миРНК Ku70 для целевой последовательности 5, поскольку вестерн-блот-анализ показал, что эта миРНК является наиболее эффективной через 72 часа после трансфекции (рис.1Б). Мы нормализовали иммуногистохимическое окрашивание Ku70 с окрашиванием 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом и количество флуоресцентного сигнала от нетрансфицированного контроля (рис. 2А). Относительный флуоресцентный сигнал на клетку был количественно определен с помощью Metamorph и нанесен на график (фиг. 2B). Ku70 siRNA для целевой последовательности 5 снизила экспрессию Ku70 в клетках HeLa до 20%, 40% и 70% через 24, 48 и 72 часа после трансфекции.

Иммунофлуоресцентный анализ изображений клеток HeLa, трансфицированных химически синтезированной миРНК Ku70 для целевой последовательности 5.Экспрессия A, Ku70 в клетках HeLa через 24, 48 и 72 ч после трансфекции миРНК Ku70. Клетки визуализировали с помощью микроскопа Olympus BX60. B, — график эффектов Ku70 siRNA (относительная флуоресценция на клетку по сравнению с нетрансфицированным образцом) на общий белок Ku, количественно определенный с помощью метаморфного анализа.

Из пяти миРНК Ku70 мы протестировали влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 на ответ на гамма-излучение, поскольку она показала максимальное ингибирование экспрессии Ku70 через 72 часа после трансфекции (рис.1Б). Фиг. 3 иллюстрирует влияние γ-излучения в присутствии воздуха на клоногенное выживание клеток HeLa через 72 часа после трансфекции миРНК Ku70. Полулогарифмический график кривых доза-ответ для контрольных клеток HeLa показал двухфазную кривую с плечом при низких дозах. Эта кривая доза-ответ типична для клеток млекопитающих. Клетки HeLa, обработанные миРНК Ku70 в течение 72 часов, были более чувствительны к индуцированной гамма-излучением гибели клеток, чем контрольные клетки HeLa. Чтобы исключить возможность того, что эффект радиосенсибилизации миРНК Ku70 может быть неспецифическим, мы также определили влияние скремблированной миРНК на ответ клеток HeLa на гамма-излучение.Результаты показали, что радиационный ответ клеток HeLa, трансфицированных скремблированной миРНК, был аналогичен таковому в контроле.

Влияние гамма-излучения в присутствии воздуха на клоногенное выживание клеток HeLa через 72 часа после трансфекции миРНК Ku70. Из пяти синтезированных миРНК Ku70 мы проверили влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 на ответ на гамма-излучение, поскольку она показала 70% ингибирование экспрессии Ku70 через 72 часа после трансфекции. Каждый эксперимент повторяли, по крайней мере, трижды с SD, как показано, если только точки не меньше нанесенных на график.

Чтобы определить общность этой миРНК Ku70 (CS # 5), мы также протестировали эффекты этой миРНК на клетки карциномы толстой кишки HCT116. Вестерн-блот-анализ с использованием того же моноклонального антитела против Ku70, которое использовалось для клеток HeLa, показал 16% ингибирование Ku70 в общих клеточных лизатах, экстрагированных из HCT116, обработанных в течение 24 часов (фиг. 4, дорожка 3 ). Уровень белка Ku был дополнительно снижен до 70% через 48 часов после трансфекции миРНК Ku70 (рис.4, переулок 6, ). Однако клетки полностью восстанавливались через 72 часа (фиг. 4, , дорожка 9, ) после трансфекции, что позволяет предположить, что максимальный ингибирующий эффект siRNA наблюдался через 48 часов после трансфекции (т.е. несколько раньше, чем клетки HeLa).

Влияние миРНК на экспрессию Ku70, измеренную с помощью вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела против Ku70 в клетках HCT116. A, Вестерн-блоттинг экстрактов клеточных белков клеток HCT116 через 24 ( дорожек 1-3 ), 48 ( дорожек 4–6 ) и 72 часа ( дорожек 7–9 ) после трансфекции миРНК Ku70 .Необработанный контроль ( дорожки 1 , 4 и 7 ), миРНК отрицательного контроля ( дорожки 2 , 5 и 8 ), химически синтезированная миРНК Ku70 для целевой последовательности # 5 ( дорожек 3 , 6 и 9 ). B, — график влияния siRNA на общий белок Ku, количественно определенный с помощью анализа изображения NIH, график каждой дорожки в геле и представлен как процент от необработанного контроля. Каждый эксперимент повторяли, по крайней мере, трижды с SD, как показано, если только точки не меньше нанесенных на график.Актин, контролирующий загрузку, не показал существенной разницы в загрузке.

Чтобы определить корреляцию между экспрессией Ku70 и радиационным ответом, мы подвергли клетки HCT116, трансфицированные Ku70 siRNA (CS # 5), облучению (рис. 5A – C). HCT116, трансфицированный в течение 48 часов, показал значительную сенсибилизацию к радиации (фиг. 5B). Однако клетки, трансфицированные в течение 24 и 72 часов, не показали какой-либо значительной радиационной сенсибилизации (фиг. 5A и C). Таким образом, радиационный отклик соответствовал изменению выражения Ku70.

Влияние гамма-излучения в присутствии воздуха на клоногенное выживание клеток карциномы толстой кишки HCT116 через 24, 48 и 72 часа после трансфекции миРНК Ku70. Мы проверили влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 на ответ на гамма-излучение. Каждый эксперимент повторяли, по крайней мере, трижды с SD, как показано, если только точки не меньше нанесенных на график.

Другим широко изученным агентом, повреждающим ДНК, является этопозид. Этот препарат вызывает повреждение ДНК, ингибируя топоизомеразу II, что приводит к двухцепочечным разрывам ДНК (15, 24).Поэтому мы измерили кривые зависимости реакции от дозы этопозида для трансфектантов клеток HeLa. Мы снова выбрали для тестирования влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 ( дорожка 7, ) на реакцию этопозида, поскольку она показала максимальное ингибирование экспрессии Ku70 через 72 часа после трансфекции (фиг. 1B). На фиг. 6 показано влияние 1-часового воздействия различных концентраций этопозида в присутствии воздуха на клоногенное выживание клеток HeLa через 72 часа после трансфекции миРНК Ku70.Клетки HeLa, обработанные миРНК Ku70 в течение 72 часов, были более чувствительны к индуцированному этопозидом уничтожению клеток, чем контрольные клетки HeLa. Результаты со скремблированной миРНК на ответ клеток HeLa на этопозид показали, что этопозидный ответ клеток HeLa, трансфицированных скремблированной миРНК, был аналогичен ответу контрольных клеток.

Влияние этопозида в присутствии воздуха на клоногенное выживание клеток HeLa через 72 часа после трансфекции миРНК Ku70. Из пяти синтезированных миРНК Ku70 мы проверили влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 на реакцию этопозида, поскольку она показала 70% ингибирование экспрессии Ku70 через 72 часа после трансфекции. Каждый эксперимент повторяли, по крайней мере, трижды с SD, как показано, если только точки не меньше нанесенных на график.

Обработка клеток HCT116 этопозидом также приводила к снижению выживаемости клеток (рис. 7A – C). Однако клетки HCT116, трансфицированные Ku70 siRNA, были намного более чувствительны к этопозиду через 48 часов после трансфекции, чем нетрансфектант (фиг. 7B). Подобно ответу трансфектантов на облучение, HCT116, трансфицированный миРНК Ku70 в течение 24 и 72 часов, не показал какой-либо значительной сенсибилизации или ингибирования экспрессии Ku; предполагая прямую корреляцию между ингибированием Ku70 и ответом на этопозид (рис.7A – C).

Влияние этопозида в присутствии воздуха на клоногенное выживание клеток карциномы толстой кишки HCT116 через 24, 48 и 72 часа после трансфекции миРНК Ku70. Мы проверили влияние химически синтезированных миРНК для целевой последовательности 5 на реакцию этопозида. Каждый эксперимент повторяли, по крайней мере, трижды с SD, как показано, если только точки не меньше нанесенных на график.

Обсуждение

Было показано, что репарационные белки играют важную роль в ответе клеток на агенты, повреждающие ДНК (24, 25).Однако из-за огромного разнообразия типов повреждений, сложности и количества репаративных белков и их комплексов часто бывает трудно точно определить точную функцию и специфичность повреждения каждого белка. Это особенно верно, потому что некоторые из репарационных мутантов были функционально изолированы до появления современных молекулярных методов. Чтобы решить эту проблему, были охарактеризованы различные мутанты. Часто кажется, что у них отсутствует функция только одного восстанавливающего белка.Было показано, что гетеродимер Ku участвует в репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством негомологичного соединения концов (26–30).

Излучение производит свободные радикалы в результате случайного радиолиза воды. Известно, что радиация вызывает гибель клеток, прежде всего, под действием групп гидроксильных радикалов, вызывающих двухцепочечные разрывы ДНК. Негомологичное соединение концов играет важную роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, вызванных γ-излучением (20, 21). Исследования с мутантными клетками грызунов с дефицитом ДНК-PKcs, Ku86 и ДНК-лигазы IV показали, что эти белки важны для негомологичного пути репарации с присоединением концов и выживания после облучения (20, 21).Из этих трех основных белков репарации ДНК Ku играет центральную роль, воспринимая повреждения ДНК и координируя различные белки репарации ДНК (15, 17, 18).

Яды топоизомеразы II также индуцируют двухцепочечные разрывы ДНК, что приводит к гибели клеток аналогично гамма-излучению. Хотя облучение непосредственно вызывает двухцепочечные разрывы, яды топоизомеразы II вызывают двухцепочечные разрывы, стабилизируя ковалентный промежуточный продукт (комплекс ДНК / топоизомераза II) реакции топоизомеразы II (15, 17, 31). Негомологичное соединение концов, вероятно, является основным путем, участвующим в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, продуцируемых ядами топоизомеразы II (15, 17, 32). Роль негомологичного белка репарации концевых соединений Ku в клеточном ответе на яд топоизомеразы II была показана с использованием штаммов XRS с дефицитом репарации двухцепочечных разрывов ДНК (15, 17, 32). Однако недавний отчет показал, что гиперчувствительность наблюдается только в Ku, а не в ДНК-PKcs-дефицитных клетках (33). Таким образом, представленная здесь работа согласуется с доминирующим эффектом истощения Ku70, вызывающего чувствительность как к ионизирующему излучению, так и к этопозиду.

Для клеток млекопитающих было показано, что недостаток Ku-86 вызывает серьезную радиационную чувствительность в линии хомяков XRS5, и этот мутант характеризуется многими другими повреждениями ДНК, включая чувствительность к ядам топоизомеразы II (15, 17, 18, 32). .Большинство исследователей сосредоточили свое внимание на мутантах с дефицитом репарации ДНК, чтобы изучить механизмы репарации ДНК (16, 28–32), и лишь несколько примеров используют молекулярное нацеливание на репарационные белки для увеличения ответа раковых клеток на агенты, повреждающие ДНК (34). Недавнее открытие того, что небольшие интерферирующие РНК эффективны в подавлении экспрессии генов в клетках млекопитающих, открыло новые возможности для подавления экспрессии репаративного белка (35, 36). Это важно по многим причинам. Напр., Хотя Ku существует как функциональный гетеродимер, мутанты Ku70 не идентифицированы.Кроме того, существует огромная разница в клеточной концентрации белков репарации, при этом клетки человека обычно содержат больше Ku и ДНК-PK, чем клетки хомяка. Неизвестно, почему это должно быть так, особенно потому, что человеческие клетки обычно более чувствительны, чем их аналоги хомяка. Наши результаты теперь показали, что миРНК Ku70 можно использовать для ингибирования синтеза белка Ku в раковых клетках человека и что это вызывает сенсибилизацию к ионизирующему излучению и этопозиду. Этот результат, возможно, является неожиданным, потому что даже при максимальном ингибировании Ku70, о котором здесь сообщается (~ 70% истощение), клетки содержат намного больше Ku, чем нормальные клетки хомяка.

Эффективность различных полученных siRNA сильно варьировалась. Только три из пяти миРНК Ku70 оказались высокоэффективными в подавлении экспрессии белка Ku. РНКаза III генерировала миРНК Ku70, также снижала белок Ku, но с гораздо меньшей эффективностью. Очевидно, будет интересно продолжить поиски более эффективного истощения Ku70, и в настоящее время мы работаем над созданием стабильной siRNA. Эффективность истощения Ku70 точно коррелировала с изменениями радиационной и этопозидной чувствительности как количественно, так и качественно.Наши результаты показывают, что Ku70 должен быть истощен по крайней мере на 70%, чтобы значительно изменить реакцию на повреждение ДНК.

Мы недавно показали, что гибель клеток, вызванная гамма-излучением, может быть усилена гидроксиэтилдисульфидом, оксидантом тиола, в мутантных клетках яичников китайского хомячка с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (10). Эта модификация радиационного ответа хорошо коррелировала с дефектами репарации двухцепочечных разрывов ДНК и потерей связывания Ku с концами ДНК (10, 14). Более высокое уничтожение клеток на два логарифма и 70% ингибирование репарации двухцепочечных разрывов ДНК и связывания Ku в клетках яичника китайского хомячка с мутантной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой предполагают, что ингибирование функции белка Ku будет высокоэффективным в повышении чувствительности раковых клеток к γ. радиация и другие химиотерапевтические агенты, повреждающие ДНК (10, 14).Однако опосредованная гидроксиэтилдисульфидом потеря функции Ku в результате модификации протеина тиолом эффективна только в клетках с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (10, 14). Наши результаты впервые показали, что трансфекция раковых клеток HeLa и HCT116 миРНК Ku70 значительно усиливает ответ на гамма-излучение и химиотерапевтический агент этопозид.

Эти текущие результаты предполагают, что нацеливание на Ku-белок с помощью Ku70 siRNA является возможным подходом к терапии рака.Это также увеличило возможности нацеливания на другие белки репарации ДНК либо отдельно, либо в сочетании с миРНК Ku70, чтобы увеличить ответ раковых клеток на агенты, повреждающие ДНК (36).

Благодарности

Мы благодарим Тима Нортона (Университет Пенсильвании) и Энджи Ченг (Ambion, Inc.) за их техническую помощь.

Footnotes

• ↵3 J.E. Biaglow et al., Личное сообщение.

• Грантовая поддержка: Грант на исследования Национального института рака CA 92108.

• Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть обозначена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

• • Принято 21 февраля 2005 г.
  • Получено 21 мая 2004 г.
  • Исправление получено 20 января 2005 г.
• Американская ассоциация исследований рака

Ссылки

1. ↵

   Coleman CN.Молекулярная биология в радиационной онкологии. Перспективы радиационной онкологии BRCA1 и BRCA2. Acta Oncol 1999; 38: 55–9.

2. Grunbaum U, Meye A, Bache M, et al. Трансфекция mdm2-антисмысловой или wtp53 приводит к радиосенсибилизации и усилению апоптоза линии клеток саркомы мягких тканей. Anticancer Res 2001; 21: 2065–71.

3. Харрис М., Кэй С.Б. Последние достижения в лечении эпителиального рака яичников. Мнение эксперта, исследующее наркотики, 2001; 10: 1715–24.

4. ↵

   Murren JR. Обоснование применения неплатиновой химиотерапии при распространенном НМРЛ. Онкология 2001; 15: 29–34.

5. Kaufmann SH. Гибель клеток, вызванная лекарствами, направленными на топоизомеразу: больше вопросов, чем ответов. Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 195–211.

6. Ньютон HB. Химиотерапия для лечения метастатических опухолей головного мозга. Эксперт Rev Anticancer Ther 2002; 2: 495–506.

7. ↵

   Ruckdeschel JC.Будущие направления немелкоклеточного рака легкого: постоянная перспектива. Онкология 1998; 12: 90–6.

8. ↵

   Grant S, Roberts JD. Использование ингибиторов циклинзависимой киназы отдельно или в комбинации с признанными цитотоксическими лекарственными средствами в химиотерапии рака. Обновление Drug Resist 2003; 6: 15–26.

9. ↵

   Baker A, Payne CM, Briehl MM, Powis G. Тиоредоксин, ген, сверхэкспрессируемый при раке человека, ингибирует апоптоз in vitro и in vivo .Cancer Res 1997; 57: 5162–7.

10. ↵

    Айен И.С., Кох С.Дж., Таттл ЮЗ, Стамато Т.Д., Перес М.Л., Биаглоу Дж. Э. Окисление клеточных тиолов гидроксиэтилдисульфидом ингибирует повторное соединение двухцепочечных разрывов ДНК в G6PD-дефицитных клетках млекопитающих. Int J Radiat Biol 2000; 76: 1523–31.

11. ↵

    Bristow RG, Benchimol S, Hill RP. Ген p53 как модификатор внутренней радиочувствительности: значение для лучевой терапии. Радиотер Онкол 1996; 40: 197–223.

12. Endo K, Kuratate I, Watanabe M, et al.Трансфекция гена p53 дикого типа в культивируемых саркомах человека: эффект CDDP. Онкол Реп 2001; 8: 637–42.

13. ↵

    Харни Дж. В., Сеймур С. Б., Мерфи Д. М., Мазерсилл С. Вариация экспрессии онкопротеинов p53, c-myc и bcl-2 в культурах отдельных пациентов нормального уротелия, подвергшихся воздействию γ-лучей кобальта 60 и N -нитрозодиэтаноламин. Эпидемиологические биомаркеры рака до 1995 г .; 4: 617–25.

14. ↵

    Айен И.С., Бернхард Э.Дж., Мушел Р.Дж., Маккенна В.Г., Криш Р.Э., Кох С.Дж.ДНК как важная мишень в радиационно-индуцированном апоптозе клеток, трансфицированных онкогеном myc и myc плюс ras. Int J Radiat Biol 2000a; 76: 343–55.

15. ↵

    Кальдекотт К., Бэнкс Г., Джегго П. Пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК и клеточная толерантность к ингибиторам топоизомеразы II. Cancer Res 1990; 50: 5778–83.

16. ↵

    Getts RC, Stamato TD. Отсутствие Ku-подобной активности связывания концов ДНК у мутанта с дефицитом репарации двухцепочечной ДНК xrs.J Biol Chem 1994; 269: 15981–4.

17. ↵

    Jeggo PA, Caldecott K, Pidsley S, Banks GR. Чувствительность мутантов яичников китайского хомячка, дефектных по репарации двухцепочечных разрывов ДНК, к ингибиторам топоизомеразы II. Cancer Res 1989; 49: 7057–63.

18. ↵

    Kemp LM, Sedgwick SG, Jeggo PA. Рентгеночувствительные мутанты клеток СНО, дефектные по повторному соединению двухцепочечного разрыва. Mutat Res 1984; 132: 189–96.

19. ↵

    Taccioli GE, Gottlieb TM, Blunt T, et al.Продукт Ku80 гена XRCC5 и его роль в репарации ДНК и рекомбинации V (D) J. Наука 1994; 265: 1442–5.

20. ↵

    Featherstone C, Jackson SP. Ku, белок репарации ДНК с множеством клеточных функций. Mutat Res 1999; 434: 3–15.

21. ↵

    Jeggo PA. Идентификация генов, участвующих в репарации двухцепочечных разрывов ДНК в клетках млекопитающих. Radiat Res 1998; 150: S80–91.

22. ↵

    Чжан В.В., Янева М. Восстановленные сульфгидрильные группы необходимы для связывания ДНК белка Ku.Biochem J 1993; 293: 769–74.

23. ↵

    Айен И.С., Стамато Т.Д., Маулдин С.К. и др. Мутация в гене глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы приводит к инактивации связывания конца Ku-ДНК во время окислительного стресса. J Biol Chem 2002; 277: 9929–35.

24. ↵

    Pommier Y. ДНК-топоизомеразы и их ингибирование антрациклинами. В: Прибе В., редактор. Антрациклиновые антибиотики. Вашингтон, округ Колумбия: Am Chem Soc; 1995. стр. 183–203.

25. ↵

    Jeggo PA, Kemp LM.Рентгеночувствительные мутанты линий клеток яичников китайского хомячка: изоляция и перекрестная чувствительность к другим агентам, повреждающим ДНК. Mutat Res 1983; 112: 313–27.

26. ↵

    Blunt T, Finnie NJ, Taccioli GE и др. Дефектная ДНК-зависимая активность протеинкиназы связана с рекомбинацией V (D) J и дефектами репарации ДНК, связанными с мутацией scid мыши. Cell 1995; 80: 813–23.

27. Smider V, Rathmell WK, Lieber MR, Chu G. Восстановление устойчивости к рентгеновским лучам и рекомбинации V (D) J в мутантных клетках с помощью кДНК Ku.Science 1994; 266: 288–91.

28. ↵

    Critchlow SE, Bowater RP, Jackson SP. Белок репарации двухцепочечных разрывов ДНК млекопитающих XRCC4 взаимодействует с ДНК-лигазой IV. Curr Biol 1997; 7: 588–98.

29. Gottlieb TM, Jackson SP. ДНК-зависимая протеинкиназа: потребность в концах ДНК и ассоциация с Ku-антигеном. Cell 1993; 72: 131–42.

30. ↵

    Grawunder U, Wilm M, Wu X и ​​др. Активность ДНК-лигазы IV стимулируется комплексообразованием с белком XRCC4 в клетках млекопитающих.Nature 1997; 388: 492–5.

31. ↵

    Li Z, Otevreil T, Gao Y, et al. Ген XRCC4 кодирует новый белок, участвующий в репарации двухцепочечных разрывов ДНК и рекомбинации V (D) J. Cell 1995; 83: 1079–89.

32. ↵

    Мимори Т., Хардин Дж. Механизм взаимодействия Ku-белка с ДНК. J Biol Chem 1986; 261: 10375–9.

33. ↵

    Кэплен, штат Нью-Джерси, Пэрриш С., Имани Ф, Файр А., Морган Р.А. Специфическое ингибирование экспрессии генов небольшими двухцепочечными РНК в системах беспозвоночных и позвоночных.Proc Natl Acad Sci U S. A 2001; 98: 9742–7.

34. ↵

    Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W., Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Дуплексы 21-нуклеотидной РНК опосредуют РНК-интерференцию в культивируемых клетках млекопитающих. Природа 2001; 411: 494–8.

35. ↵

    Jin S, Inoue S, Weaver DT. Дифференциальная чувствительность к этопозиду клеток, дефицитных по компонентам Ku и DNA-PKcs ДНК-зависимой протеинкиназы. Канцерогенез 1998; 19: 965–71.

36. ↵

    Peng Y, Zhang Q, Nagasawa H, Okayasu R, Liber HL, Bedford JS.Подавление экспрессии каталитической субъединицы ДНК-зависимой протеинкиназы малой интерферирующей РНК сенсибилизирует человеческие клетки на радиационно-индуцированное повреждение хромосом, уничтожение клеток и мутации. Cancer Res 2002; 62: 6400–44.

LNB диапазона Ka, LNB диапазона Ku, LNB диапазона X и LNB диапазона C

BUC в Ka-диапазоне, BUC в Ku-диапазоне, BUC в диапазоне X и BUC в диапазоне C

Направления | Международный прием

Добраться сюда легко — Лоуренс находится на I-70, всего в 45 минутах езды от международного аэропорта Канзас-Сити. I-70 202 — это самый прямой путь к кампусу KU.

Вы должны заплатить за парковку в гараже на Миссисипи-стрит. Больше информации.

При выходе из аэропорта следуйте указателям на Topeka, которые будут направлять вас к:

1. Поверните налево на съезд 29 N / 435 W в сторону St. Joseph / Topeka. Продолжайте движение 3,5 мили
2. Сверните на выезд 17 на 435 южной широты в сторону Топики и пройдите 29 миль.
3. Сверните на съезд 12 на 70 W / Kansas Turnpike в сторону Топики и пройдите 25 миль.
4. Сверните на съезд 202 «West Lawrence» и заплатите за проезд (около 2 долларов.00)
5. После пункта взимания платы вы поедете на юг по Макдональд-Драйв. Вы пройдете под эстакадой и выйдете на улицу Айова-стрит.
6. Поверните налево с Айова-стрит на Девятую улицу.
7. Поверните направо с Девятой улицы на улицу Миссисипи.
8. Двигайтесь по Миссисипи-стрит мимо 11-й улицы и выезжайте на кампус. Слева вы увидите гараж для посетителей.
9. Пешком по бульвару Джейхок до Стронг-Холла. Международный прием находится в комнате 45. Добро пожаловать в KU!

1. Сверните на съезд 202, West Lawrence и заплатите за проезд
.
2. После пункта взимания платы вы поедете на юг по Макдональд-Драйв.Вы пройдете под эстакадой и выйдете на улицу Айова-стрит.
3. Поверните налево с Айова-стрит на Девятую улицу.
4. Поверните направо с Девятой улицы на улицу Миссисипи.
5. Двигайтесь по Миссисипи-стрит мимо 11-й улицы и выезжайте на кампус. Слева вы увидите гараж для посетителей.
6. Пешком по бульвару Джейхок до Стронг-Холла. Международный прием находится в комнате 45. Добро пожаловать в KU!

1. Двигайтесь по шоссе Kansas 10 (K-10) на запад в сторону Лоуренса.Продолжайте ехать через Лоуренс примерно 3,25 мили.
2. Поверните направо на Айова-стрит.
3. Поверните направо с Айова-стрит на Девятую улицу.
4. Поверните направо с Девятой улицы на улицу Миссисипи.
5. Двигайтесь по Миссисипи-стрит мимо 11-й улицы и выезжайте на кампус. Слева вы увидите гараж для посетителей.
6. Пешком по бульвару Джейхок до Стронг-Холла. Международный прием находится в комнате 45. Добро пожаловать в KU!

1. Взять U.S. 59 Шоссе на север в Лоуренс. Продолжайте ехать через Лоуренса до Девятой улицы.
2. Поверните направо на Девятую улицу.
3. Поверните направо с Девятой улицы на улицу Миссисипи.
4. Двигайтесь по Миссисипи-стрит мимо 11-й улицы и выезжайте на кампус. Слева вы увидите гараж для посетителей.
5. Пешком по бульвару Джейхок до Стронг-Холла. Международный прием находится в комнате 45. Добро пожаловать в KU!

МШУ с одной резьбой — диапазон Ku, МШУ / МШУ

МШУ с одной резьбой — диапазон Ku

Сноски :
Таблицы данных доступны по запросу.